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摘要：目的 探讨凋膜止崩方对大鼠子宫内膜增生症子宫内膜组织中MMP-1及TIMP-1mRNA表达的影响，为一种临床治疗无排卵型功血（ADUB）的新方法---中药靶向干预子宫内膜增生症提供理论依据。方法 应用RT--PCR技术从基因水平检测凋膜止崩方对去势雌性大鼠增生症子宫内膜组织中MMP-1及其抑制因子TIMP-1 mRNA表达的影响。结果 用药组子宫内膜组织中MMP-1mRNA的表达均显著低于正常空白组，而TIMP-1mRNA的表达均显著高于正常空白组（P<005）。结论 凋膜止崩方对子宫内膜增生症组织中MMP-1及其抑制因子TIMP-1mRNA有显著影响，抑制MMP-1mRNA的表达，而促进TIMP-1mRNA的表达，破坏增生过长的子宫内膜，达到彻底治愈功血的目的，替代宫腔镜下子宫内膜电切术（TCRE），克服了手术的部分副作用，值得临床推广应用。
关键词：凋膜止崩方；子宫内膜增生症；基质金属蛋白酶；基质金属蛋白酶抑制物
中图分类号：R2855 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2016）08-0075-03
【Abstract】Objective：To study the effect ofDiaomozhibeng Prescription on MMP-1 and TIMP-1mRNA expression of endometrial hyperplasia tissues in rats and to provide a theoretical basis for anovulatory dysfunctional uterine bleeding（ADUB）method，ieTCM targeted intervention endometrial hyperplasiaMethods：RT-PCR technique was used to detect genetically the effect ofDiaomozhibeng Prescription on MMP-1 and TIMP-1 mRNA expression of endometrial hyperplasia tissues in ovariectomized ratsResults：The expression of MMP-1mRNA endometrial tissue of the treatment group was significantly lower than that of the normal control group，but the expression of TIMP-1mRNA was significantly higher than that of the normal control group（P
【Key words】Diaomozhibeng Prescription，endometrial hyperplasia，matrix metalloproteinase，matrix metalloproteinase inhibitor
凋膜止崩方由鸦胆子油、莪术和元胡组成。鸦胆子油是由鸦胆子果实用石油醚提取所得的脂肪油，加入乳化剂而成的。经实验研究和大量临床病例证实，鸦胆子油乳[1-2]对白血病、结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、Lweis肺癌及肉瘤确有显著的抑制效果。
基质金属蛋白酶（MMP-1）是基质金属蛋白酶家族的第一个成员，在结构上由10个外显子和9个内含子组成。基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）是体内MMPs的天然特异性组织抑制剂，广泛存在于组织和体液中，能以1：1克分子比例与MMP-1酶原或活性酶非共价结合，从而抑制MMP-1酶原活化及其活性[3]。子宫内膜增生症是由于子宫内膜受雌激素持续作用而无孕酮拮抗所发生的不同程度的增殖性改变，近年来发病率有上升趋势。本实验采用不同浓度的凋膜止崩方作用于去势雌性大鼠增生症子宫内膜组织，观察增生过长子宫内膜组织中MMP-1及TIMP-1 mRNA表达的变化，探讨中药靶向干预子宫内膜增生症的作用机制，为临床用药提供理论依据。
1 资料与方法
11 实验材料与分组 健康成年SD雌性大鼠（大鼠批号，许可证号：SCXK陕2007-001）45只，体重（200±20）g，购自西安交通大学医学院实验动物中心。将购回的大鼠适应性喂养3 d，随机分成4组，分组情况如下：空白组：10只；对照组：10只；小剂量组：10只；大剂量组：10只。造膜：空白组仅行开关腹，其余三组均去掉大鼠卵巢组织（去卵巢目的：使大鼠不排卵即造成无排卵型功血），术后3天空白组各大鼠给肌注花生油015 mL/100 g，其余3组大鼠均肌注苯甲酸雌二醇015 mL/100 g隔日1次，连续10次后各组随机处死2只取其子宫病理证实为子宫内膜增生症（其中有4例为复杂性增生即出现背靠背现象，3例为单纯性增生，1例无变化）；免疫组化证实子宫内膜组织中MMP-1与TIMP-1的表达（见图1-8）3天后将生理盐水06 mL（因雌性大鼠子宫为双子宫，一侧容积为03 mL）注入对照组大鼠双侧子宫腔内。将已配好的凋膜止崩液（小剂量0001 g/06 mL即单侧为00005 g/03 mL）注入小剂量组大鼠的双侧子宫腔内；（大剂量0002 g/06 mL即单侧为0001 g/03 mL）注入大剂量组大鼠的双侧子宫腔内，连续喂养3 d。
12 检测方法 提取组织后，通过BESTBIO-贝博提供试剂盒完成cDNA的合成，由北京奥科生物技术有限责任公司设计引物，以cDNA为模板进行PCR反应，获取电泳图后。通过Flourchem V 20Stand A lone软件计算组织中的MMP-1，TIMP-1mRNA表达水平。
13 统计学处理 应用美国SPSS130统计软件分析系统资料采用F检验后进行t检验比较差异。P<005认为差异有统计学意义。 2 结果
21 凋膜止崩方对MMP-1及TIMP-1mRNA表达的影响，见图9-10。RT-PCR结果显示：空白组，对照组，大剂量组，小剂量组MMP-1条带与内参照GAPDH条带灰度比值分别为：132、143、046、072。TIMP-1条带与内参照GAPDH条带灰度比值分别为：119、080、101、095，MMP-1mRNA在对照组中表达最高，在用药组中的表达明显降低。TIMP-1mRNA在用药组中的表达明显升高，在对照组中表达降低（P<005）。
3 讨论
凋膜止崩方中鸦胆子[4]又名老胆子、苦参子。其作用为可清热、泻火并解毒、截疟治痢、腐蚀赘疣。
MMPs是一组调节复杂钙及锌依耐的中性蛋白酶家族，是细胞外基质降解过程中的重要酶类[5]，MMPs的活性调节在组织重建，炎症及肿瘤生长、组织侵袭、转移等过程中起重要作用。在正常稳态组织中MMPs表达量极少，而在炎性细胞因子，激素，生长因子刺激下其表达量上升，从而在许多生理及病理过程中扮演重要角色。TIMPs是一组能抑制MMP活性的多功能因子家族。TIMPs主要是从MMP酶原活性阶段，在活化的MMP阶段两个方面抑制MMP的激活，其表达受激素、细胞因子和生长因子等多方面调控[6]。TIMP通过调节MMP的活性调控细胞外基质（ECM）的更新，细胞外基质合成与降解过程的协调依赖于二者间的平衡[7]。子宫内膜周期性的增生和剥脱生理过程中无疑贯穿着组织的崩解和重建，因此MMPs和TIMPs的协调表达必然在这一过程中起着关键作用[8]。近年来，在ADUB的研究中也比较关注MMPs和TIMPs的表达和变化，研究表明[9]MMPs和TIMPs的表达异常与功能失调性子宫出血的发生有一定的关系，而抑制MMPs的活性成为功能失调性子宫出血治疗的又一新靶点。另外，且研究还表明[10]MMPs在降解ECM的同时，还具有调节细胞生长，凋亡，分化等更广泛而复杂的生物学作用，而TIMP能抑制血管生成素，诱导血管内皮细胞出芽[11]。
本实验结果显示：凋膜止崩方对增生症子宫内膜组织中MMP-1，TIMP-1有明显影响，可使MMP-1mRNA的表达明显降低，而TIMP-1mRNA的表达明显增加，表明TIMP-1可有效抑制子宫内膜过度增生及侵袭生长，推测凋膜止崩方可能是通过抑制子宫内膜部分炎症因子，切断细胞因子作用途径达到间接抑制MMPs 分泌的目的，还可能是通过增加孕激素受体（PR）数量以使内膜对孕酮反应增强[12]，进而抑制MMP的合成与释放，替代宫腔镜下子宫内膜电切术，克服了手术的部分副作用（如子宫穿孔、水中毒、电灼伤、气体栓塞等），给子宫内膜增生症的治疗提供了新的靶点，为凋膜止崩方在临床治疗子宫内膜增生症提供了理论依据。
参考文献：
[1]徐叔云，卞如廉，陈修药理实验方法学[M].第3版北京：人民卫生出版社，2001，203，1537
[2]刘晓兰，陈家旭，刘燕，等去甲斑螯素诱导HIbO细胞凋亡的研究[J].北京中医大学学报，2000，23（4）：36-38
[3]BakerAH，ZaltsmanAB，GerorgeSJ，etalDivergenteffdetsoftissueinhibitor of matrixmetaloproteinase-l，-2or-3，*over Pressionrat vaseularsmoothmus ulteellinvasion，Proliferation，anddeathinvitro，TIMP-3promotesapoptosisJ ClinInvest，2010，101（6）：1478-1487
[4]颜增光，蒋国芳鸦胆子及其药理研究概述[D]广西科学院学报，2008，14（1）：3-6
[5]Nagaseh，woessnerJFJrlMatrixmetallopoteminaseslJBiolChem 2009，274：21491-214941
[6]张弓MMP-9及TIMP-1在功能失调性子宫出血中的作用[J].现代医药卫生，2008；24（11）：1584-86
[7]Nagase h，woessner J F J rl Matrix metallopoteminasesl J Biol Chem 2007，274：21491-214941
[8]Isakak，Nishi，H，nakaiH，etal，Matrix metallopoteminase-26 is expressed in human Endsmetrium but not in endometrial carcinoma[J]cancer，200397-89
[9]Galant C，Berliere M，Dubois D，et alFocal expression and final activity of matrix metalloproteinases may explain irregular dysfunctional endometrial bleeding[J].Am J Pathol2004 Jul；165（1）：83-94
[10]Isakak，Nishi，H，nakaiH，etal，Matrix metallopoteminase-26 is expressed in human Endsmetrium but not in endometrialcarcinoma[J]cancer，201397-89
[11]Kim I，Kim H g，MOONso，etalAngiopoietin-1 induces endothelial cell sprouting through theactioation of focal adhesion Kinase and plasmin secretion[J]Cric Res，2000，86（9）：952-959
[12]Charnock-Jones Ds，Sharkey AM，Rajput-Williams J，et al，Identification and localization of alternately spliced mRNAs for vascular endomertrial carcinoma cell linesBiol Repord，1993（48）：1120-1128
（收稿日期：2016-05-23）
关键词：凋膜止崩方；子宫内膜增生症；基质金属蛋白酶；基质金属蛋白酶抑制物
中图分类号：R2855 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2016）08-0075-03
【Abstract】Objective：To study the effect ofDiaomozhibeng Prescription on MMP-1 and TIMP-1mRNA expression of endometrial hyperplasia tissues in rats and to provide a theoretical basis for anovulatory dysfunctional uterine bleeding（ADUB）method，ieTCM targeted intervention endometrial hyperplasiaMethods：RT-PCR technique was used to detect genetically the effect ofDiaomozhibeng Prescription on MMP-1 and TIMP-1 mRNA expression of endometrial hyperplasia tissues in ovariectomized ratsResults：The expression of MMP-1mRNA endometrial tissue of the treatment group was significantly lower than that of the normal control group，but the expression of TIMP-1mRNA was significantly higher than that of the normal control group（P
【Key words】Diaomozhibeng Prescription，endometrial hyperplasia，matrix metalloproteinase，matrix metalloproteinase inhibitor
凋膜止崩方由鸦胆子油、莪术和元胡组成。鸦胆子油是由鸦胆子果实用石油醚提取所得的脂肪油，加入乳化剂而成的。经实验研究和大量临床病例证实，鸦胆子油乳[1-2]对白血病、结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、Lweis肺癌及肉瘤确有显著的抑制效果。
基质金属蛋白酶（MMP-1）是基质金属蛋白酶家族的第一个成员，在结构上由10个外显子和9个内含子组成。基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）是体内MMPs的天然特异性组织抑制剂，广泛存在于组织和体液中，能以1：1克分子比例与MMP-1酶原或活性酶非共价结合，从而抑制MMP-1酶原活化及其活性[3]。子宫内膜增生症是由于子宫内膜受雌激素持续作用而无孕酮拮抗所发生的不同程度的增殖性改变，近年来发病率有上升趋势。本实验采用不同浓度的凋膜止崩方作用于去势雌性大鼠增生症子宫内膜组织，观察增生过长子宫内膜组织中MMP-1及TIMP-1 mRNA表达的变化，探讨中药靶向干预子宫内膜增生症的作用机制，为临床用药提供理论依据。
1 资料与方法
11 实验材料与分组 健康成年SD雌性大鼠（大鼠批号，许可证号：SCXK陕2007-001）45只，体重（200±20）g，购自西安交通大学医学院实验动物中心。将购回的大鼠适应性喂养3 d，随机分成4组，分组情况如下：空白组：10只；对照组：10只；小剂量组：10只；大剂量组：10只。造膜：空白组仅行开关腹，其余三组均去掉大鼠卵巢组织（去卵巢目的：使大鼠不排卵即造成无排卵型功血），术后3天空白组各大鼠给肌注花生油015 mL/100 g，其余3组大鼠均肌注苯甲酸雌二醇015 mL/100 g隔日1次，连续10次后各组随机处死2只取其子宫病理证实为子宫内膜增生症（其中有4例为复杂性增生即出现背靠背现象，3例为单纯性增生，1例无变化）；免疫组化证实子宫内膜组织中MMP-1与TIMP-1的表达（见图1-8）3天后将生理盐水06 mL（因雌性大鼠子宫为双子宫，一侧容积为03 mL）注入对照组大鼠双侧子宫腔内。将已配好的凋膜止崩液（小剂量0001 g/06 mL即单侧为00005 g/03 mL）注入小剂量组大鼠的双侧子宫腔内；（大剂量0002 g/06 mL即单侧为0001 g/03 mL）注入大剂量组大鼠的双侧子宫腔内，连续喂养3 d。
12 检测方法 提取组织后，通过BESTBIO-贝博提供试剂盒完成cDNA的合成，由北京奥科生物技术有限责任公司设计引物，以cDNA为模板进行PCR反应，获取电泳图后。通过Flourchem V 20Stand A lone软件计算组织中的MMP-1，TIMP-1mRNA表达水平。
13 统计学处理 应用美国SPSS130统计软件分析系统资料采用F检验后进行t检验比较差异。P<005认为差异有统计学意义。 2 结果
21 凋膜止崩方对MMP-1及TIMP-1mRNA表达的影响，见图9-10。RT-PCR结果显示：空白组，对照组，大剂量组，小剂量组MMP-1条带与内参照GAPDH条带灰度比值分别为：132、143、046、072。TIMP-1条带与内参照GAPDH条带灰度比值分别为：119、080、101、095，MMP-1mRNA在对照组中表达最高，在用药组中的表达明显降低。TIMP-1mRNA在用药组中的表达明显升高，在对照组中表达降低（P<005）。
3 讨论
凋膜止崩方中鸦胆子[4]又名老胆子、苦参子。其作用为可清热、泻火并解毒、截疟治痢、腐蚀赘疣。
MMPs是一组调节复杂钙及锌依耐的中性蛋白酶家族，是细胞外基质降解过程中的重要酶类[5]，MMPs的活性调节在组织重建，炎症及肿瘤生长、组织侵袭、转移等过程中起重要作用。在正常稳态组织中MMPs表达量极少，而在炎性细胞因子，激素，生长因子刺激下其表达量上升，从而在许多生理及病理过程中扮演重要角色。TIMPs是一组能抑制MMP活性的多功能因子家族。TIMPs主要是从MMP酶原活性阶段，在活化的MMP阶段两个方面抑制MMP的激活，其表达受激素、细胞因子和生长因子等多方面调控[6]。TIMP通过调节MMP的活性调控细胞外基质（ECM）的更新，细胞外基质合成与降解过程的协调依赖于二者间的平衡[7]。子宫内膜周期性的增生和剥脱生理过程中无疑贯穿着组织的崩解和重建，因此MMPs和TIMPs的协调表达必然在这一过程中起着关键作用[8]。近年来，在ADUB的研究中也比较关注MMPs和TIMPs的表达和变化，研究表明[9]MMPs和TIMPs的表达异常与功能失调性子宫出血的发生有一定的关系，而抑制MMPs的活性成为功能失调性子宫出血治疗的又一新靶点。另外，且研究还表明[10]MMPs在降解ECM的同时，还具有调节细胞生长，凋亡，分化等更广泛而复杂的生物学作用，而TIMP能抑制血管生成素，诱导血管内皮细胞出芽[11]。
本实验结果显示：凋膜止崩方对增生症子宫内膜组织中MMP-1，TIMP-1有明显影响，可使MMP-1mRNA的表达明显降低，而TIMP-1mRNA的表达明显增加，表明TIMP-1可有效抑制子宫内膜过度增生及侵袭生长，推测凋膜止崩方可能是通过抑制子宫内膜部分炎症因子，切断细胞因子作用途径达到间接抑制MMPs 分泌的目的，还可能是通过增加孕激素受体（PR）数量以使内膜对孕酮反应增强[12]，进而抑制MMP的合成与释放，替代宫腔镜下子宫内膜电切术，克服了手术的部分副作用（如子宫穿孔、水中毒、电灼伤、气体栓塞等），给子宫内膜增生症的治疗提供了新的靶点，为凋膜止崩方在临床治疗子宫内膜增生症提供了理论依据。
参考文献：
[1]徐叔云，卞如廉，陈修药理实验方法学[M].第3版北京：人民卫生出版社，2001，203，1537
[2]刘晓兰，陈家旭，刘燕，等去甲斑螯素诱导HIbO细胞凋亡的研究[J].北京中医大学学报，2000，23（4）：36-38
[3]BakerAH，ZaltsmanAB，GerorgeSJ，etalDivergenteffdetsoftissueinhibitor of matrixmetaloproteinase-l，-2or-3，*over Pressionrat vaseularsmoothmus ulteellinvasion，Proliferation，anddeathinvitro，TIMP-3promotesapoptosisJ ClinInvest，2010，101（6）：1478-1487
[4]颜增光，蒋国芳鸦胆子及其药理研究概述[D]广西科学院学报，2008，14（1）：3-6
[5]Nagaseh，woessnerJFJrlMatrixmetallopoteminaseslJBiolChem 2009，274：21491-214941
[6]张弓MMP-9及TIMP-1在功能失调性子宫出血中的作用[J].现代医药卫生，2008；24（11）：1584-86
[7]Nagase h，woessner J F J rl Matrix metallopoteminasesl J Biol Chem 2007，274：21491-214941
[8]Isakak，Nishi，H，nakaiH，etal，Matrix metallopoteminase-26 is expressed in human Endsmetrium but not in endometrial carcinoma[J]cancer，200397-89
[9]Galant C，Berliere M，Dubois D，et alFocal expression and final activity of matrix metalloproteinases may explain irregular dysfunctional endometrial bleeding[J].Am J Pathol2004 Jul；165（1）：83-94
[10]Isakak，Nishi，H，nakaiH，etal，Matrix metallopoteminase-26 is expressed in human Endsmetrium but not in endometrialcarcinoma[J]cancer，201397-89
[11]Kim I，Kim H g，MOONso，etalAngiopoietin-1 induces endothelial cell sprouting through theactioation of focal adhesion Kinase and plasmin secretion[J]Cric Res，2000，86（9）：952-959
[12]Charnock-Jones Ds，Sharkey AM，Rajput-Williams J，et al，Identification and localization of alternately spliced mRNAs for vascular endomertrial carcinoma cell linesBiol Repord，1993（48）：1120-1128
（收稿日期：2016-05-23）