【摘 要】
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应用克隆的基因组序列作为同源臂,构建了小鼠β-酪蛋白基因定位敲人打靶载体.短臂长2.7kb,包括小鼠p-酪蛋白基因5端侧翼区、第1外显子、第1内含子、部分第2外显子.长臂包括小
【基金项目】
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国家高技术研究发展计划(863计划);
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应用克隆的基因组序列作为同源臂,构建了小鼠β-酪蛋白基因定位敲人打靶载体.短臂长2.7kb,包括小鼠p-酪蛋白基因5端侧翼区、第1外显子、第1内含子、部分第2外显子.长臂包括小鼠β-酪蛋白基因部分第2内含子、第3～7外显子、第3～6内含子、部分第7内含子,长3.4 kb.人t-PA突变体cDNA在第2外显子中与小鼠β-酪蛋白信号肽序列融合.正筛选标记neo放置在β-酪蛋白基因第2内含子中部,负筛选标记tk位于短臂外侧.ES细胞株TC-1在滋养层上培养扩增.处理ES细胞使其密度达到2×107个/mL后,将45 p,g线性化的打靶载体DNA与1 mL细胞混匀后电击.转染的细胞在含G418和Gancyclovir的选择培养基中培养,7 d后挑取192个抗性克隆,扩增、提取基因组DNA,EcoR I酶切后,用打靶载体5端内侧探针进行Southern杂交,野生型出现9.8 kb,而中靶的β-酪蛋白基因由于敲入的人t-PA突变体携带一个EcoR I位点,中靶等位基因出现6.6 kb.从78株ES细胞株中获得1株发生正确同源重组的中靶ES细胞.
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