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摘要：为建立巴马香猪肉中游离氨基酸的指纹图谱，采用L-8900全自动氨基酸分析仪测定猪肉中的游离氨基酸，选择17个主要特征峰为指纹图谱共有峰。建立了7份巴马香猪肉游离氨基酸指纹图谱，与同一地区养殖的巴马本地猪、杜洛克猪、大白猪肉中的游离氨基酸指纹图谱相比，巴马香猪具有较高的相似度。结果表明，建立的指纹图谱有较好的精密度、重复性、稳定性，可作为巴马香猪肉的鉴别参考。
关键词：巴马香猪；游离氨基酸；指纹图谱
中图分类号： TS251.1文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0156-04
巴马香猪是具有悠久饲养历史、稳定遗传基因且品质优良、珍贵稀有的地方小型猪品种，原产于广西巴马瑶族自治县[1]。它以皮薄肉细、味美甘香、营养丰富而闻名。随着巴马香猪的出名，许多不法商家受利益驱动，用一些其他品种土猪冒充巴马香猪，导致巴马香猪市场鱼龙混杂，严重损害了消费者利益。目前对巴马香猪的鉴别都是以猪种的形态体征为主，尚无任何研究对巴马香猪猪肉的肉质性状进行分析鉴别。营养和风味成分是肉质性状的重要指标，其中游离氨基酸含量是直接影响猪肉风味的重要参数[2]。本研究对巴马香猪肌肉中游离氨基酸指纹图谱进行研究分析，为巴马香猪的鉴别研究以及为优质猪肉的开发利用提供依据，也为我国地方猪种资源的保护和利用提供肉质特性方面的基础性资料。
1材料与方法
1.1样品来源
猪肉样品来自巴马瑶族自治县内3家巴马香猪养殖场：巴马原种香猪农牧实业有限公司、广西巴马三和农牧发展有限公司、良集原种香猪农民合作社，品种批号详见表1。
1.2仪器与试剂
L-8900全自动氨基酸分析仪（日本日立公司）；30种氨基酸混合标准（日本日立公司）；Basic均质器（德国IKA公司）；三氟乙酸（分析纯）。
1.3试验方法
1.3.1样品前处理将样品解冻，用匀浆机把猪肌肉样品打成匀浆备用。
1.3.2供试品溶液的制备将新鲜猪肉粉碎后，准确称取1.000 g，加入5%三氟乙酸25 mL，用均质器将肌肉组织捣碎、分散、超声30 min、离心，取上清液用0.45 μm滤膜过滤，得供试液。
1.3.3色谱条件分析柱是Na型离子交换色谱柱（4.6 mm×60 nm，3 μm），流动相为锂盐缓冲液，双通道检测，流速分别为0.45、0.35 mL/min，检测波长分别为420、570 nm，柱温57 ℃，柱后衍生，衍生剂为茚三酮缓冲液，反应温度为135 ℃[3]。将混合标准液稀释至25 nmol/mL，标准液和供试液进样量均为20 μL，色谱记录时间为120 min。氨基酸色谱结果见图1、图2。
1.4方法学考察
1.4.1共有峰的确定在120 min内选择峰面积较高的17个主要特征峰为共有峰。通过与对照品图谱比对，将其中保留时间为50.56 min的10号峰亮氨酸（Leu）峰作为参比峰，详见表2。
1.4.2精密度考察精确吸取供试品溶液5 μL，连续进样6次，直观观察指纹图谱的全貌无明显差别，用相似度计算，色谱指纹图谱的相似度均大于0.980，表明该仪器的精密度良好。
1.4.3稳定性考察设置样品盘温度为4 ℃，取同一份供试品溶液，分别在0.0、1.0、1.5、2.0、5.0、10.0 h进行测定，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，用相似度计算，指纹图谱的相似度均大于0.980，供试品溶液成分在72 h内是稳定的。
1.4.4重复性同一批样品取样5份，按“1.3.2”节方法操作依法测定。6份供试品溶液测得的色谱指纹图谱全貌直观观察无明显变化，用相似度计算，指纹图谱的相似度均大于0.980，该方法的重复性较好。
1.4.5样品指纹图谱检测取猪肉样品19批次，按“1.3.2”节制备样品，按“1.3.3”节条件检测，得到19批样品游离氨基酸图谱，计算相对保留时间和相对峰面积，求出RSD值。
2结果与分析
2.1指纹图谱相似度计算
按检测方法进行测定，得出19批样品的游离氨基酸图谱，表3、表4分别为19批猪肉游离氨基酸色谱图共有峰的相對面积、相对保留时间。用19批次样品图谱分别与199号样品对比，采用中药材指纹图谱相似度评价软件，19批样品指纹游离氨基酸图谱匹配后结果见图3，根据公式用夹角余弦法计算相似度，结果见表5。
2.2相似度评价
以199号巴马香猪为参照，200、201、205、206、207、208号巴马香猪样品游离氨基酸指纹图谱相似度较好，相似度均大于0.960。其他猪种虽偶有相似度达0.973（151号杜洛克猪），但整体相似度较差，说明不同品种猪肉中游离氨基酸指纹图谱确实存在细微的差异。
3结论与讨论
本研究选用猪肉中游离氨基酸来研究氨基酸指纹图谱，与常规的18种氨基酸分析程序相比，分析时间较短（35 min），如选用检测高温水解氨基酸，强酸高温的情况下会破坏某些特殊氨基酸。采用氨基酸生理体液测定系统测定肉中的游离氨基酸含量，分析时间较长（120 min），分析氨基酸的种类更多，除组成天然蛋白质基本结构的20种氨基酸外，还可以分析很多特殊的其他氨基酸，这些特殊氨基酸都是20种基本氨基酸中某种氨基酸的衍生物，都是在其母体氨基酸中参入多肽链后经酶促修饰产生的，此类氨基酸都是某些特殊蛋白质的成分。这些氨基酸的功能和作用有些已明确，有些尚在研究中。研究表明，游离氨基酸的存在与肉产品滋味有很大关系，有些游离氨基酸不仅直接形成滋味，而且还是很多风味物质的前体物质[4]。因此选用生理体液系统分析游离氨基酸指纹图谱，更能体现不同种类猪肉的特征。
本研究结果表明，用L-8900氨基酸分析仪建立的游离氨基酸指纹图谱有较好的精密度、重复性、稳定性。与其他猪种相比，巴马香猪样品游离氨基酸指纹图谱相似度较好，而其他品种的猪肉相似度稍差。本研究结果虽然可以初步在指纹图谱上区分巴马香猪和其他品种猪，但是由于样品有限，尚难以证明本方法的有效性和代表性。本研究需要建立大量样品基础，才具有统计学意义。今后仍要通过收集多样、具有代表性、不同品种、不同生活环境的猪肉样本，开展氨基酸指纹研究，经严谨细致的数据统计分析，从中得出规律和差异，从而确立和验证巴马香猪肉产品和其他猪肉产品的可靠稳定指纹图谱鉴别方法。
参考文献：
[1]莫玉萍、钟舒红、唐敏桃，等. 广西巴马香猪的种质特征开发利用[J]. 地方猪种，2011，28（10）：116-118.
[2]王拮，袁希平，王安奎，等. 牛品种、性别对高档牛肉粗蛋白和氨基酸含量的影响[J]. 云南农业大学学报，2011，26（5）：633-638.
[3]王翠丽，柏雪，邱翔，等. 乌骨鸡肉中氨基酸组成和肌苷酸含量的分析[J]. 西南民族大学学报（自然科学版），2011，37（1）：90-92.
[4]孙亚伟，张笑莹，张晓红，等. 新疆褐牛不同部位肌肉氨基酸组成及分析[J]. 新疆农业大学学报，2010，33（4）：299-302.
关键词：巴马香猪；游离氨基酸；指纹图谱
中图分类号： TS251.1文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0156-04
巴马香猪是具有悠久饲养历史、稳定遗传基因且品质优良、珍贵稀有的地方小型猪品种，原产于广西巴马瑶族自治县[1]。它以皮薄肉细、味美甘香、营养丰富而闻名。随着巴马香猪的出名，许多不法商家受利益驱动，用一些其他品种土猪冒充巴马香猪，导致巴马香猪市场鱼龙混杂，严重损害了消费者利益。目前对巴马香猪的鉴别都是以猪种的形态体征为主，尚无任何研究对巴马香猪猪肉的肉质性状进行分析鉴别。营养和风味成分是肉质性状的重要指标，其中游离氨基酸含量是直接影响猪肉风味的重要参数[2]。本研究对巴马香猪肌肉中游离氨基酸指纹图谱进行研究分析，为巴马香猪的鉴别研究以及为优质猪肉的开发利用提供依据，也为我国地方猪种资源的保护和利用提供肉质特性方面的基础性资料。
1材料与方法
1.1样品来源
猪肉样品来自巴马瑶族自治县内3家巴马香猪养殖场：巴马原种香猪农牧实业有限公司、广西巴马三和农牧发展有限公司、良集原种香猪农民合作社，品种批号详见表1。
1.2仪器与试剂
L-8900全自动氨基酸分析仪（日本日立公司）；30种氨基酸混合标准（日本日立公司）；Basic均质器（德国IKA公司）；三氟乙酸（分析纯）。
1.3试验方法
1.3.1样品前处理将样品解冻，用匀浆机把猪肌肉样品打成匀浆备用。
1.3.2供试品溶液的制备将新鲜猪肉粉碎后，准确称取1.000 g，加入5%三氟乙酸25 mL，用均质器将肌肉组织捣碎、分散、超声30 min、离心，取上清液用0.45 μm滤膜过滤，得供试液。
1.3.3色谱条件分析柱是Na型离子交换色谱柱（4.6 mm×60 nm，3 μm），流动相为锂盐缓冲液，双通道检测，流速分别为0.45、0.35 mL/min，检测波长分别为420、570 nm，柱温57 ℃，柱后衍生，衍生剂为茚三酮缓冲液，反应温度为135 ℃[3]。将混合标准液稀释至25 nmol/mL，标准液和供试液进样量均为20 μL，色谱记录时间为120 min。氨基酸色谱结果见图1、图2。
1.4方法学考察
1.4.1共有峰的确定在120 min内选择峰面积较高的17个主要特征峰为共有峰。通过与对照品图谱比对，将其中保留时间为50.56 min的10号峰亮氨酸（Leu）峰作为参比峰，详见表2。
1.4.2精密度考察精确吸取供试品溶液5 μL，连续进样6次，直观观察指纹图谱的全貌无明显差别，用相似度计算，色谱指纹图谱的相似度均大于0.980，表明该仪器的精密度良好。
1.4.3稳定性考察设置样品盘温度为4 ℃，取同一份供试品溶液，分别在0.0、1.0、1.5、2.0、5.0、10.0 h进行测定，直观观察指纹图谱的全貌无明显变化，用相似度计算，指纹图谱的相似度均大于0.980，供试品溶液成分在72 h内是稳定的。
1.4.4重复性同一批样品取样5份，按“1.3.2”节方法操作依法测定。6份供试品溶液测得的色谱指纹图谱全貌直观观察无明显变化，用相似度计算，指纹图谱的相似度均大于0.980，该方法的重复性较好。
1.4.5样品指纹图谱检测取猪肉样品19批次，按“1.3.2”节制备样品，按“1.3.3”节条件检测，得到19批样品游离氨基酸图谱，计算相对保留时间和相对峰面积，求出RSD值。
2结果与分析
2.1指纹图谱相似度计算
按检测方法进行测定，得出19批样品的游离氨基酸图谱，表3、表4分别为19批猪肉游离氨基酸色谱图共有峰的相對面积、相对保留时间。用19批次样品图谱分别与199号样品对比，采用中药材指纹图谱相似度评价软件，19批样品指纹游离氨基酸图谱匹配后结果见图3，根据公式用夹角余弦法计算相似度，结果见表5。
2.2相似度评价
以199号巴马香猪为参照，200、201、205、206、207、208号巴马香猪样品游离氨基酸指纹图谱相似度较好，相似度均大于0.960。其他猪种虽偶有相似度达0.973（151号杜洛克猪），但整体相似度较差，说明不同品种猪肉中游离氨基酸指纹图谱确实存在细微的差异。
3结论与讨论
本研究选用猪肉中游离氨基酸来研究氨基酸指纹图谱，与常规的18种氨基酸分析程序相比，分析时间较短（35 min），如选用检测高温水解氨基酸，强酸高温的情况下会破坏某些特殊氨基酸。采用氨基酸生理体液测定系统测定肉中的游离氨基酸含量，分析时间较长（120 min），分析氨基酸的种类更多，除组成天然蛋白质基本结构的20种氨基酸外，还可以分析很多特殊的其他氨基酸，这些特殊氨基酸都是20种基本氨基酸中某种氨基酸的衍生物，都是在其母体氨基酸中参入多肽链后经酶促修饰产生的，此类氨基酸都是某些特殊蛋白质的成分。这些氨基酸的功能和作用有些已明确，有些尚在研究中。研究表明，游离氨基酸的存在与肉产品滋味有很大关系，有些游离氨基酸不仅直接形成滋味，而且还是很多风味物质的前体物质[4]。因此选用生理体液系统分析游离氨基酸指纹图谱，更能体现不同种类猪肉的特征。
本研究结果表明，用L-8900氨基酸分析仪建立的游离氨基酸指纹图谱有较好的精密度、重复性、稳定性。与其他猪种相比，巴马香猪样品游离氨基酸指纹图谱相似度较好，而其他品种的猪肉相似度稍差。本研究结果虽然可以初步在指纹图谱上区分巴马香猪和其他品种猪，但是由于样品有限，尚难以证明本方法的有效性和代表性。本研究需要建立大量样品基础，才具有统计学意义。今后仍要通过收集多样、具有代表性、不同品种、不同生活环境的猪肉样本，开展氨基酸指纹研究，经严谨细致的数据统计分析，从中得出规律和差异，从而确立和验证巴马香猪肉产品和其他猪肉产品的可靠稳定指纹图谱鉴别方法。
参考文献：
[1]莫玉萍、钟舒红、唐敏桃，等. 广西巴马香猪的种质特征开发利用[J]. 地方猪种，2011，28（10）：116-118.
[2]王拮，袁希平，王安奎，等. 牛品种、性别对高档牛肉粗蛋白和氨基酸含量的影响[J]. 云南农业大学学报，2011，26（5）：633-638.
[3]王翠丽，柏雪，邱翔，等. 乌骨鸡肉中氨基酸组成和肌苷酸含量的分析[J]. 西南民族大学学报（自然科学版），2011，37（1）：90-92.
[4]孙亚伟，张笑莹，张晓红，等. 新疆褐牛不同部位肌肉氨基酸组成及分析[J]. 新疆农业大学学报，2010，33（4）：299-302.