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摘要：为构建盘羊杂交羊SPLUNC1基因的真核表达载体并在巴斯德毕赤酵母中表达，从盘羊杂交羊口腔上颚的上皮细胞中提取总RNA，并反转录成cDNA，以该cDNA为模板采用逆转录PCR（RT-PCR）法克隆盘羊杂交羊SPLUNC1基因开放阅读框，并克隆到pPIC9K载体中，构建真核表达载体pPIC9K-SPLUNC1，再将重组质粒电转至毕赤酵母GS115中进行表达，表达产物经Ni-NTA琼脂亲和层析纯化，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western Blot）方法检测。结果显示，目的基因大小758 bp，重组表达质粒pPIC9K-SPLUNC1经双酶切、PCR及测序鉴定构建成功；表达产物经SDS-PAGE分析，可见大小为25.96 ku的目的条带，且在72 h表达量最大；纯化后经SDS-PAGE和Western Blot分析，可见大小为25.96 ku的目的条带。研究结果表明，利用真核表达系统在体外成功表达并纯化了盘羊杂交羊rSPLUNC1蛋白，为深入研究盘羊杂交羊SPLUNC1蛋白的生物学功能奠定基础。
关键词：盘羊杂交羊；短颚、肺及鼻咽上皮细胞克隆1；融合蛋白；真核表达
中图分类号： Q786文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0130-04
气道上皮细胞构成宿主防御的第一道防线，上皮细胞分泌物有助于防止病原体侵害，协调免疫反应，并限制肺损伤。呼吸道分泌物含有大量蛋白质，这些蛋白很多是由上皮细胞分泌的，并在黏膜纤毛的清除、抗菌防御和免疫调节中有很重要的作用。其中短颚、肺及鼻咽上皮细胞克隆1（short palate，lung and nasal epithelium clone 1，简称SPLUNC1）基因就高效表达于口腔、鼻腔、鼻咽部及呼吸道黏膜[1]。
很多研究表明SPLUNC1是呼吸道黏膜分泌的具有抗菌活性的重要蛋白，体外的研究表明，重组人SPLUNC1被证实具有杀灭流感嗜血杆菌的抗菌活性[2]。Zhou等研究证明，使用不同浓度重组人SPLUNC1蛋白，可以减少铜绿假单胞菌的生长且具有剂量依赖性[3]。许多研究证实SPLUNC1在体内也具有较强的抗菌活性。Di研究证实，在被铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌感染时，过表达人SPLUNC1的转基因小鼠比野生型小鼠抗菌活性明显增强[4]。此外，过表达人SPLUNC1的转基因小鼠与同窝出生的野生型小鼠相比对肺炎支原体（mycoplasma pneumonia，简称Mp）感染的抵抗力显著增强[5]。据报道，重组小鼠SPLUNC1蛋白可显著抑制Mp的生长且具有剂量依赖性[6]。研究还表明，SPLUNC1具有结合革兰氏阴性菌脂多糖的能力[7-8]。相关研究显示，用逆转录PCR（RT-PCR）法检测鼻咽癌活检组织的SPLUNC1 mRNA表达水平，发现其比正常组织的表达量明显下降，推测SPLUNC1可能是鼻咽癌的抑癌基因[9]。但目前对SPLUNC1功能的研究主要集中在人和鼠，还未见羊的有关该基因功能的相关报道。因此，本试验通过构建盘羊杂交羊SPLUNC1基因真核表达载体，利用巴斯德毕赤酵母对SPLUNC1基因进行表达，使用Western Blot对目的蛋白检测，为研究盘羊杂交羊SPLUNC1蛋白的生物学功能奠定基础。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1试剂
大肠杆菌DH5α由笔者所在实验室保存；T4 DNA连接酶（天根生化科技有限公司）；反转录试剂盒、SnaBⅠ、NotⅠ、SacⅠ和Taq聚合酶，均购自TaKaRa公司；酵母氮碱（YNB）、G418、生物素，均购自索莱宝科技有限公司；蛋白Marker（Thermo）；酵母基因组DNA快速提取试剂盒、质粒小量提取制备试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA Marker DL2501和DNA Marker DL2503，购自上海捷瑞生物工程有限公司；Ni-NTA琼脂（QIAGEN公司）；封闭液、一抗（Anti-His Antibody），购自天根生化科技（北京）有限公司；二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（北京诺博莱德科技有限公司）；蛋白预染Marker（北京全式金生物技术有限公司）；GS115菌株及pPIC9K由新疆农垦科学院兽医研究所薄新文研究员馈赠。
1.1.2试验动物
盘羊杂交羊F1 5只，由石河子绿洲动物园提供。
1.2方法
1.2.1引物设计
根据笔者所在实验室已克隆的盘羊杂交羊SPLUNC1基因cDNA全长序列，使用Primer5软件设计1对特异性引物，并引入6×His标签以及SnaBⅠ、NotⅠ酶切位点。上游引物SPL1：5′-TACGTAATGCACCACCACCACCACCACCTGCTAGAAGCCCTGCCCG-3′，下游引物SPL2：5′-GCGGCCGCTCAGACTTTGATGACAAATTCTAGCCC-3′。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
1.2.2总RNA的提取及目的片段的扩增
用高压灭菌的药匙刮取盘羊杂交羊口腔上颚上皮细胞，置于1.5 mL离心管中，迅速加入1 mL TRIzol提取总RNA。用微量紫外检测仪对RNA进行浓度测定，用2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。选用电泳条带完整清晰且D260 nm/D280 nm值为1.9～2.0的RNA进行cDNA的合成。
用反转录试剂盒，以提取的总RNA为模板进行cDNA合成，以该cDNA为模板，用引物SPL1和SPL2進行PCR扩增，反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，65 ℃ 35 s，72 ℃ 60 s，34个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，目的片段胶回收后，-20 ℃保存备用。 1.2.3重组表达质粒pPIC9K-SPLUNC1的获得
用SnaBⅠ和NotⅠ分别对盘羊杂交羊SPLUNC1基因扩增产物及pPIC9K载体进行双酶切，用T4 DNA连接酶连接。用10 μL连接产物转化100 μL感受态细胞DH5α，16 ℃过夜。转化后涂布于含有100 mg/L氨苄青霉素的LB琼脂板，37 ℃过夜。挑取5个单菌落，接种于10 mL含有100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃、170 r/min振荡过夜。取1 mL菌液，提取质粒，进行PCR鉴定和双酶切鉴定，同时将1mL菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司測序。测序正确的重组质粒命名为pPIC9K-SPLUNC1。
1.2.4重组表达质粒pPIC9K-SPLUNC1的转化与重组菌株鉴定
取80 μL感受态酵母菌GS115与20 μL SacⅠ线性化的重组表达质粒pPIC9K-SPLUNC1混合，电击转化后涂布于MD平板，28 ℃孵育约3 d，直至出现单菌落。
挑取5个单菌落，用酵母基因组快速提取试剂盒提取酵母基因组DNA，以其为模板，分别用特异性表达引物和载体上的通用引物（α-Factor：5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′）作基因型和表型鉴定。基因型鉴定的PCR反应条件同目的片段的扩增。表型鉴定的反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，34个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分析。将表现型、基因型均鉴定正确的重组毕赤酵母依次接种至G418含量分别为0.25、050、1.00、2.00 mg/mL的YPD平板进行抗性筛选高拷贝，阳性菌株命名为GS115/pPIC9K-SPLUNC1。
1.2.5重组GS115/pPIC9K-SPLUNC1的诱导表达与产物的鉴定
将鉴定正确的重组GS115/pPIC9K-SPLUNC1接种于25 mL YPD液体培养基中，28 ℃恒温培养至D600 nm约为4，8 000 r/min离心3 min，收集菌体。将菌体转接于100 mL BMMY培养基中继续培养。每24 h加入终浓度为0.5%的甲醇诱导表达，同时分别于0、24、48、72 h取1 mL菌液样品，离心收集上清和菌体，并将上清和菌体分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。
1.2.6表达产物的纯化及Western Blot鉴定
将SDS-PAGE结果含目的条带的表达产物用0.45 μm的滤膜过滤，滤液经Ni-NTA琼脂亲和层析柱，用10～15倍体积的结合缓冲液（pH值为8.0的50 mmol/L磷酸盐缓冲液，含 0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑）进行漂洗，直到吸光度达到稳定值，分管收集流出液体；用洗脱缓冲液（pH值为8.0的50 mmol/L磷酸盐缓冲液含0.5 mol/L NaCl，300 mmol/L咪唑）进行洗脱，分别收集流出液体并且经SDS-PAGE分析。
纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳后，将蛋白电转到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，然后将膜置于封闭液中封闭1 h；一抗Anti-His标签的鼠单克隆抗体（按1 ∶[KG-*3]2 000稀释）4 ℃孵育过夜，过夜后用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（TBS） 吐温（T）（TBST）洗3次（10 min/次），二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（按1 ∶[KG-*3]5 000稀释）室温孵育90 min，然后用TBST洗3次（10 min/次），最后用二氨基联苯胺（DAB）显色液进行显色。
2结果与分析
2.1目的片段的扩增
以反转录获得的cDNA为模板，用特异性表达引物进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，出现大小为758 bp的条带，与预期片段大小相符合（图1）。
2.2重组表达质粒pPIC9K-SPLUNC1的鉴定
用特异性表达引物对重组表达质粒pPIC9K-SPLUNC1进行PCR，鉴定出现大小为758 bp的1条带，与试验设计相符（图2）。经SnaBⅠ和NotⅠ双酶切出现2条带，1条大小约为10 kb，与载体片段大小相同；另1条大小为758 bp，与外源目的片段大小相同（图3）。重组表达质粒pPIC9K-SPLUNC1的鉴定显示，目的基因已克隆到pPIC9K载体中。
2.3重组菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1的PCR鉴定
以提取的重组酵母菌的基因组为模板，用特异性表达引物进行PCR，出现大小为758 bp的1条带（图4）。用载体上的通用引物进行PCR扩增，出现2条带（图5）。重组表达系统的PCR鉴定结果表明，重组表达酵母菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1转化成功。
2.4SPLUNC1融合蛋白的鉴定
重组菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1经甲醇诱导表达后，培养上清经SDS-PAGE检测，在25.96 ku出现1条目的条带，与预测的目的蛋白大小相符，而在空载体表达产物和 0 h 未见有相同条带（图6），这表明重组SPLUNC1蛋白已表达成功。菌体经SDS-PAGE分析无预测的目的蛋白条带。
2.5SPLUNC1融合蛋白的纯化与鉴定
表达的蛋白经Ni-NTA琼脂亲和层析纯化后，SDS-PAGE结果得到单一的大小为25.96 ku的融合蛋白目的条带（图7），纯化后的融合蛋白经Western Blot分析，结果在 25.96 ku 处出现1条明显的蛋白条带（图8），由此说明已在酵母中成功表达SPLUNC1融合蛋白并纯化成功。 3讨论
本试验以盘羊杂交羊为研究对象，通过RT-PCR法扩增其SPLUNC1开放阅读框，克隆到pPIC9K载体上，并电转至GS115中用甲醇诱导表达，使用Ni-NTA琼脂亲和层析纯化，SDS-PAGE检测结果显示成功获得重组表达菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1和SPLUNC1融合蛋白。
近年来，通过将目的基因克隆到表达载体中，并将重组质粒导入真核表达系统中使其高效表达，是研究该基因功能及获得重组蛋白的有效方法[10]。本试验采用巴斯德毕赤酵母作为真核表达菌株。巴斯德毕赤酵母表达系统是外源蛋白表达过程中被广泛使用的真核表达系统，也是目前外源蛋白表达系统中最方便、最有效的表达系统之一[11]。外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中高效表达，有利于表达后蛋白纯化、降低生产成本，在生产中具有重要意义[12]。巴斯德毕赤酵母能利用甲醇作为碳源，因为甲醇能够诱导醇氧化酶（AOX）基因表达，产生AOX1，从而使其含量为总细胞蛋白含量的30%～40%[13]。本试验的宿主菌为GS115菌株，该菌株具有完整的编码AOX1基因，在含甲醇的培养基中能够迅速生长，所以表型为Mut （甲醇利用快速型），同时可以使外源蛋白得到高效表达。本试验结果显示，SPLUNC1融合蛋白在72 h表达量最大。
本研究所用的载体为pPIC9K载体，是一种分泌型载体。此载体以组氨醇脱氢酶基因（His4）为选择标记，同时含有AOX1基因启动子、终止子和卡那霉素抗性基因标记等。这样的组合方式既有利于外源基因通过该质粒整合到酵母基因组中，也有利于重组酵母的筛选、表达以及外源蛋白的纯化、检测。本试验结果显示，甲醇诱导表达后SPLUNC1融合蛋白存在于重组酵母培养上清液中，而在菌体中无目的蛋白，这表明使用pPIC9K载体可使目的蛋白分泌到培养液中。与固定化金属离子作用最强的氨基酸为组氨酸，多聚组氨酸标签因其在表达过程中对目的蛋白性质影响较小以及纯化方法简单、方便、成本低等优点在蛋白质亲和纯化中被广泛使用[14]。因此，本研究在设计引物时加入6×His标签，所表达的蛋白含有His标签，便于后续试验中蛋白纯化和检测。本试验结果显示，所表达的His融合蛋白经Ni-NTA纯化后杂蛋白减少，且能与抗His标签抗体结合。
蛋白免疫印迹（Western Blot）结合了分辨率高的电泳技术以及高特异性和敏感性的酶免疫测定技术，是蛋白分析的一种常规技术，用于检测样品中是否存在特异蛋白[15]。本研究所表达的SPLUNC1融合蛋白含6×His标签，因此本试验使用His标签抗体进行蛋白免疫印迹检测表达产物中是否含有带His标签的SPLUNC1融合蛋白。结果显示，出现1条特异性条带，与预测相符，表明表达产物中存在SPLUNC1融合蛋白。
有资料报道，盘羊（[XZ（20#]♂[XZ）]）与巴什拜羊（♀）的杂交后代羔羊易感染绵羊肺炎支原体（mycoplasma ovipneumoniae，简称Mo）而引起大量死亡[16]。SPLUNC1基因是宿主先天性防御肺炎支原体感染的关键基因。本试验利用毕赤酵母成功表达并纯化了盘羊雜交羊SPLUNC1融合蛋白，为进一步研究盘羊杂交羊SPLUNC1基因的生物学功能奠定了基础。
参考文献：
[1]薛君力，周立娟，曾姣娥，等. 天然免疫相关蛋白分子SPLUNC1载体构建及蛋白稳定表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志，2015，31（4）：500-503.
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关键词：盘羊杂交羊；短颚、肺及鼻咽上皮细胞克隆1；融合蛋白；真核表达
中图分类号： Q786文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）14-0130-04
气道上皮细胞构成宿主防御的第一道防线，上皮细胞分泌物有助于防止病原体侵害，协调免疫反应，并限制肺损伤。呼吸道分泌物含有大量蛋白质，这些蛋白很多是由上皮细胞分泌的，并在黏膜纤毛的清除、抗菌防御和免疫调节中有很重要的作用。其中短颚、肺及鼻咽上皮细胞克隆1（short palate，lung and nasal epithelium clone 1，简称SPLUNC1）基因就高效表达于口腔、鼻腔、鼻咽部及呼吸道黏膜[1]。
很多研究表明SPLUNC1是呼吸道黏膜分泌的具有抗菌活性的重要蛋白，体外的研究表明，重组人SPLUNC1被证实具有杀灭流感嗜血杆菌的抗菌活性[2]。Zhou等研究证明，使用不同浓度重组人SPLUNC1蛋白，可以减少铜绿假单胞菌的生长且具有剂量依赖性[3]。许多研究证实SPLUNC1在体内也具有较强的抗菌活性。Di研究证实，在被铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌感染时，过表达人SPLUNC1的转基因小鼠比野生型小鼠抗菌活性明显增强[4]。此外，过表达人SPLUNC1的转基因小鼠与同窝出生的野生型小鼠相比对肺炎支原体（mycoplasma pneumonia，简称Mp）感染的抵抗力显著增强[5]。据报道，重组小鼠SPLUNC1蛋白可显著抑制Mp的生长且具有剂量依赖性[6]。研究还表明，SPLUNC1具有结合革兰氏阴性菌脂多糖的能力[7-8]。相关研究显示，用逆转录PCR（RT-PCR）法检测鼻咽癌活检组织的SPLUNC1 mRNA表达水平，发现其比正常组织的表达量明显下降，推测SPLUNC1可能是鼻咽癌的抑癌基因[9]。但目前对SPLUNC1功能的研究主要集中在人和鼠，还未见羊的有关该基因功能的相关报道。因此，本试验通过构建盘羊杂交羊SPLUNC1基因真核表达载体，利用巴斯德毕赤酵母对SPLUNC1基因进行表达，使用Western Blot对目的蛋白检测，为研究盘羊杂交羊SPLUNC1蛋白的生物学功能奠定基础。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1试剂
大肠杆菌DH5α由笔者所在实验室保存；T4 DNA连接酶（天根生化科技有限公司）；反转录试剂盒、SnaBⅠ、NotⅠ、SacⅠ和Taq聚合酶，均购自TaKaRa公司；酵母氮碱（YNB）、G418、生物素，均购自索莱宝科技有限公司；蛋白Marker（Thermo）；酵母基因组DNA快速提取试剂盒、质粒小量提取制备试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA Marker DL2501和DNA Marker DL2503，购自上海捷瑞生物工程有限公司；Ni-NTA琼脂（QIAGEN公司）；封闭液、一抗（Anti-His Antibody），购自天根生化科技（北京）有限公司；二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（北京诺博莱德科技有限公司）；蛋白预染Marker（北京全式金生物技术有限公司）；GS115菌株及pPIC9K由新疆农垦科学院兽医研究所薄新文研究员馈赠。
1.1.2试验动物
盘羊杂交羊F1 5只，由石河子绿洲动物园提供。
1.2方法
1.2.1引物设计
根据笔者所在实验室已克隆的盘羊杂交羊SPLUNC1基因cDNA全长序列，使用Primer5软件设计1对特异性引物，并引入6×His标签以及SnaBⅠ、NotⅠ酶切位点。上游引物SPL1：5′-TACGTAATGCACCACCACCACCACCACCTGCTAGAAGCCCTGCCCG-3′，下游引物SPL2：5′-GCGGCCGCTCAGACTTTGATGACAAATTCTAGCCC-3′。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
1.2.2总RNA的提取及目的片段的扩增
用高压灭菌的药匙刮取盘羊杂交羊口腔上颚上皮细胞，置于1.5 mL离心管中，迅速加入1 mL TRIzol提取总RNA。用微量紫外检测仪对RNA进行浓度测定，用2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。选用电泳条带完整清晰且D260 nm/D280 nm值为1.9～2.0的RNA进行cDNA的合成。
用反转录试剂盒，以提取的总RNA为模板进行cDNA合成，以该cDNA为模板，用引物SPL1和SPL2進行PCR扩增，反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，65 ℃ 35 s，72 ℃ 60 s，34个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，目的片段胶回收后，-20 ℃保存备用。 1.2.3重组表达质粒pPIC9K-SPLUNC1的获得
用SnaBⅠ和NotⅠ分别对盘羊杂交羊SPLUNC1基因扩增产物及pPIC9K载体进行双酶切，用T4 DNA连接酶连接。用10 μL连接产物转化100 μL感受态细胞DH5α，16 ℃过夜。转化后涂布于含有100 mg/L氨苄青霉素的LB琼脂板，37 ℃过夜。挑取5个单菌落，接种于10 mL含有100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃、170 r/min振荡过夜。取1 mL菌液，提取质粒，进行PCR鉴定和双酶切鉴定，同时将1mL菌液送北京六合华大基因科技股份有限公司測序。测序正确的重组质粒命名为pPIC9K-SPLUNC1。
1.2.4重组表达质粒pPIC9K-SPLUNC1的转化与重组菌株鉴定
取80 μL感受态酵母菌GS115与20 μL SacⅠ线性化的重组表达质粒pPIC9K-SPLUNC1混合，电击转化后涂布于MD平板，28 ℃孵育约3 d，直至出现单菌落。
挑取5个单菌落，用酵母基因组快速提取试剂盒提取酵母基因组DNA，以其为模板，分别用特异性表达引物和载体上的通用引物（α-Factor：5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′和3′AOX1：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′）作基因型和表型鉴定。基因型鉴定的PCR反应条件同目的片段的扩增。表型鉴定的反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，34个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分析。将表现型、基因型均鉴定正确的重组毕赤酵母依次接种至G418含量分别为0.25、050、1.00、2.00 mg/mL的YPD平板进行抗性筛选高拷贝，阳性菌株命名为GS115/pPIC9K-SPLUNC1。
1.2.5重组GS115/pPIC9K-SPLUNC1的诱导表达与产物的鉴定
将鉴定正确的重组GS115/pPIC9K-SPLUNC1接种于25 mL YPD液体培养基中，28 ℃恒温培养至D600 nm约为4，8 000 r/min离心3 min，收集菌体。将菌体转接于100 mL BMMY培养基中继续培养。每24 h加入终浓度为0.5%的甲醇诱导表达，同时分别于0、24、48、72 h取1 mL菌液样品，离心收集上清和菌体，并将上清和菌体分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。
1.2.6表达产物的纯化及Western Blot鉴定
将SDS-PAGE结果含目的条带的表达产物用0.45 μm的滤膜过滤，滤液经Ni-NTA琼脂亲和层析柱，用10～15倍体积的结合缓冲液（pH值为8.0的50 mmol/L磷酸盐缓冲液，含 0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑）进行漂洗，直到吸光度达到稳定值，分管收集流出液体；用洗脱缓冲液（pH值为8.0的50 mmol/L磷酸盐缓冲液含0.5 mol/L NaCl，300 mmol/L咪唑）进行洗脱，分别收集流出液体并且经SDS-PAGE分析。
纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳后，将蛋白电转到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，然后将膜置于封闭液中封闭1 h；一抗Anti-His标签的鼠单克隆抗体（按1 ∶[KG-*3]2 000稀释）4 ℃孵育过夜，过夜后用三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（TBS） 吐温（T）（TBST）洗3次（10 min/次），二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（按1 ∶[KG-*3]5 000稀释）室温孵育90 min，然后用TBST洗3次（10 min/次），最后用二氨基联苯胺（DAB）显色液进行显色。
2结果与分析
2.1目的片段的扩增
以反转录获得的cDNA为模板，用特异性表达引物进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，出现大小为758 bp的条带，与预期片段大小相符合（图1）。
2.2重组表达质粒pPIC9K-SPLUNC1的鉴定
用特异性表达引物对重组表达质粒pPIC9K-SPLUNC1进行PCR，鉴定出现大小为758 bp的1条带，与试验设计相符（图2）。经SnaBⅠ和NotⅠ双酶切出现2条带，1条大小约为10 kb，与载体片段大小相同；另1条大小为758 bp，与外源目的片段大小相同（图3）。重组表达质粒pPIC9K-SPLUNC1的鉴定显示，目的基因已克隆到pPIC9K载体中。
2.3重组菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1的PCR鉴定
以提取的重组酵母菌的基因组为模板，用特异性表达引物进行PCR，出现大小为758 bp的1条带（图4）。用载体上的通用引物进行PCR扩增，出现2条带（图5）。重组表达系统的PCR鉴定结果表明，重组表达酵母菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1转化成功。
2.4SPLUNC1融合蛋白的鉴定
重组菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1经甲醇诱导表达后，培养上清经SDS-PAGE检测，在25.96 ku出现1条目的条带，与预测的目的蛋白大小相符，而在空载体表达产物和 0 h 未见有相同条带（图6），这表明重组SPLUNC1蛋白已表达成功。菌体经SDS-PAGE分析无预测的目的蛋白条带。
2.5SPLUNC1融合蛋白的纯化与鉴定
表达的蛋白经Ni-NTA琼脂亲和层析纯化后，SDS-PAGE结果得到单一的大小为25.96 ku的融合蛋白目的条带（图7），纯化后的融合蛋白经Western Blot分析，结果在 25.96 ku 处出现1条明显的蛋白条带（图8），由此说明已在酵母中成功表达SPLUNC1融合蛋白并纯化成功。 3讨论
本试验以盘羊杂交羊为研究对象，通过RT-PCR法扩增其SPLUNC1开放阅读框，克隆到pPIC9K载体上，并电转至GS115中用甲醇诱导表达，使用Ni-NTA琼脂亲和层析纯化，SDS-PAGE检测结果显示成功获得重组表达菌株GS115/pPIC9K-SPLUNC1和SPLUNC1融合蛋白。
近年来，通过将目的基因克隆到表达载体中，并将重组质粒导入真核表达系统中使其高效表达，是研究该基因功能及获得重组蛋白的有效方法[10]。本试验采用巴斯德毕赤酵母作为真核表达菌株。巴斯德毕赤酵母表达系统是外源蛋白表达过程中被广泛使用的真核表达系统，也是目前外源蛋白表达系统中最方便、最有效的表达系统之一[11]。外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中高效表达，有利于表达后蛋白纯化、降低生产成本，在生产中具有重要意义[12]。巴斯德毕赤酵母能利用甲醇作为碳源，因为甲醇能够诱导醇氧化酶（AOX）基因表达，产生AOX1，从而使其含量为总细胞蛋白含量的30%～40%[13]。本试验的宿主菌为GS115菌株，该菌株具有完整的编码AOX1基因，在含甲醇的培养基中能够迅速生长，所以表型为Mut （甲醇利用快速型），同时可以使外源蛋白得到高效表达。本试验结果显示，SPLUNC1融合蛋白在72 h表达量最大。
本研究所用的载体为pPIC9K载体，是一种分泌型载体。此载体以组氨醇脱氢酶基因（His4）为选择标记，同时含有AOX1基因启动子、终止子和卡那霉素抗性基因标记等。这样的组合方式既有利于外源基因通过该质粒整合到酵母基因组中，也有利于重组酵母的筛选、表达以及外源蛋白的纯化、检测。本试验结果显示，甲醇诱导表达后SPLUNC1融合蛋白存在于重组酵母培养上清液中，而在菌体中无目的蛋白，这表明使用pPIC9K载体可使目的蛋白分泌到培养液中。与固定化金属离子作用最强的氨基酸为组氨酸，多聚组氨酸标签因其在表达过程中对目的蛋白性质影响较小以及纯化方法简单、方便、成本低等优点在蛋白质亲和纯化中被广泛使用[14]。因此，本研究在设计引物时加入6×His标签，所表达的蛋白含有His标签，便于后续试验中蛋白纯化和检测。本试验结果显示，所表达的His融合蛋白经Ni-NTA纯化后杂蛋白减少，且能与抗His标签抗体结合。
蛋白免疫印迹（Western Blot）结合了分辨率高的电泳技术以及高特异性和敏感性的酶免疫测定技术，是蛋白分析的一种常规技术，用于检测样品中是否存在特异蛋白[15]。本研究所表达的SPLUNC1融合蛋白含6×His标签，因此本试验使用His标签抗体进行蛋白免疫印迹检测表达产物中是否含有带His标签的SPLUNC1融合蛋白。结果显示，出现1条特异性条带，与预测相符，表明表达产物中存在SPLUNC1融合蛋白。
有资料报道，盘羊（[XZ（20#]♂[XZ）]）与巴什拜羊（♀）的杂交后代羔羊易感染绵羊肺炎支原体（mycoplasma ovipneumoniae，简称Mo）而引起大量死亡[16]。SPLUNC1基因是宿主先天性防御肺炎支原体感染的关键基因。本试验利用毕赤酵母成功表达并纯化了盘羊雜交羊SPLUNC1融合蛋白，为进一步研究盘羊杂交羊SPLUNC1基因的生物学功能奠定了基础。
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