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摘 要：目的：对福建地区铁皮石斛中氨基酸的含量进行测定。方法：本实验对照品为天冬氨酸，采用紫外-可见分光光度法测定（UV）铁皮石斛中氨基酸的含量，并进行方法学考察。结果：对照品天冬氨酸线性关系良好（ Y = 2. 5264X -0. 0579（ r = 0. 9998） ），精密度、重复性良好，显色反应在30min内稳定性良好，平均回收率99.27%。其中三明市铁皮石斛的氨基酸含量最高。结论：铁皮石斛中氨基酸的含量测定方法重复性、准确性良好，且操作简单，本实验为福建地区铁皮石斛的筛选提供了依据。
关键词：铁皮石斛 紫外分光度法 总氨基酸 含量测定
一、引言
铁皮石斛俗称铁皮枫斗，是我国传统名贵中药，民间又称其为“救命仙草”，药界的“大熊猫”，铁皮石斛味甘，性微寒，有生津养胃、滋阴清热、润肺益肾、润喉明目、强腰的功效。现代研究表明铁皮石斛可提高机体免疫力、抗肿瘤、抑制血栓形成、延缓衰老的作用。其有效成分包括氨基酸、多糖等。本实验采用紫外-可见分光光度法（UV）来测定铁皮石斛中氨基酸的含量，为以后铁皮石斛氨基酸的含量测定提供实验实验方法及依据。
二、实验材料
紫外分光度计（日本岛津），恒温干燥箱（DHG-9040A），分析天平（JJ324BC美国双杰电子天平）天冬氨酸对照品购自中国药品生物制品检定所（批号 200711），茚三酮（无锡市展望化工试剂有限公司），CH3COONa（天津博迪化学股份有限公司）所有试剂均为分析纯。铁皮石斛采于福建漳州市、三明市、泉州市、龙岩市、南平市、福州市，经******鉴定为兰科植物铁皮石斛的干燥茎。
三、方法与结果
1.对照品溶液的制备。将天冬氨酸对照品干燥至恒重，精密称取对照品10. 34 mg，配置为1.034mg/ml的对照品储备液。取储备液5ml配置0.1034mg/ml的对照品溶液。
2.供试品溶液的制备。将铁皮石斛粗粉精密称取1.00g，将其置于置具塞锥形瓶中，加入0. 1 mol/L的HCl 溶液20ml，超声提取0.5h后抽滤，滤液用15%的NaOH溶液调至中性并转移至100 m L 量瓶中，加水至刻度即得。
3.检测波长的确定。取2ml天冬氨酸对照品溶液和12ml供试品溶液分别加入各1. 0 m L的 p H为 6. 5的 CH3COONa 缓冲盐溶液和2%茚三酮溶液后进行全波长扫描，确定565为最大吸收波长。
4.标准曲线的绘制。精密移取天冬氨酸对照品溶液 1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4. 0 m L，分别置于25m L 量瓶中，分别补水至4. 0 m L，充分摇匀后置于沸水浴中加热40 min，取出后放冷15 min后加水定容。精密加入显色剂（各1. 0 m L的 p H为 6. 5的 CH3COONa 缓冲盐溶液和2%茚三酮溶液）摇匀，以相应溶剂为空白溶液在 565 nm处测定吸光度，横坐标为天冬氨酸溶液质量浓度，测得的吸光度为纵坐标，得回归方程 Y = 2. 5264X -0. 0579（ r = 0. 9998） 。
5.方法学考察。
5.1精密度试验。精密取2.0ml对照品溶液和12. 0 m L供试品溶液，按2. 4 项下方法于565nm 处重复测定6次吸光度值，结果对照品溶液吸光度RSD值为0.34%，供试品溶液吸光度RSD值为0.67%。试验结果表明该方法的精密度良好。
5.2稳定性试验。精密移取2.0ml对照品溶液和12. 0 m L供试品溶液，按2. 4 项下方法于565nm 分别于 0，10，20，30，40，50min 测定吸光度值，结果对照品溶液吸光度RSD值为2.98%，供试品溶液吸光度RSD值为3.2%。对照品溶液在30min以内的吸光度RSD值为1.67%，供试品溶液在30min以内的吸光度RSD值为2.07%，因此，该显色反应应控制在30min内。
5.3重复性试验。取同一批药材按 2. 2 项下的方法制备供试品溶液，精密移取12. 0 m L供试品溶液，按2. 4 项下方法于565nm 处重复测定6次吸光度值，结果氨基酸质量分数（ 0. 227 ± 0. 004） % ，RSD值为 1. 5% 。试验结果表明该方法的重复性良好。
5.4加样回收率试验。取已知含量的铁皮石斛药材粗粉精密称定2. 0 g，平行称定 6 份，按 2. 2 项下方法制备供试品溶液（氨基酸含量为0. 2486 mg），按 2. 4 项下方法操作并精密加入天冬氨酸对照品0. 24 mg，结果见表1。
四、铁皮石斛含量测定
取不同产地的铁皮石斛粗粉2g，按 2. 2 项下方法制备供试品溶液（氨基酸 含量为0. 2486 mg），按 2. 4 项下方法操作，测定氨基酸含量。结果发现三明市铁皮石斛的氨基酸含量最高。
五、結语
长年无节制采掘导致铁皮石斛的自然繁殖率极低，铁皮石斛的自然资源开始日趋枯竭，目前为止，已基本无野生铁皮石斛资源可用，在 1987 年铁皮石斛作为三级珍稀濒危保护植物被《中国珍稀濒危保护植物名录》收录，同时也作为二类药材品种被野生药材资源保护管理条例》收录。
氨基酸为铁皮石斛的有效成分之一，本实验首先建立铁皮石斛中氨基酸的含量测定方法，结果对照品天冬氨酸线性关系良好，精密度、重复性良好，显色反应在30min内稳定性良好，平均回收率99.27%。其中三明市铁皮石斛的氨基酸含量最高。综上所述，铁皮石斛中氨基酸的含量测定方法重复性、准确性良好，且操作简单，本实验为福建地区铁皮石斛的筛选提供了依据。
参考文献：
[1]鲁芹飞. 铁皮石斛质量评价及干燥工艺研究[D].广州中医药大学，2014.
[2]张亮，鲁芹飞，张扬，徐香琴，徐兰芳，曾毅，黄松. 柱前衍生化RP-HPLC测定铁皮石斛中的氨基酸的含量[J]. 中国实验方剂学杂志，2014，（22）：61-65.
[3]王培培，鲁芹飞，李婧，黄松，陈建南. 铁皮石斛中总氨基酸的含量测定及提取工艺优选[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，（14）：30-33.
[4]李光，李学兰，陈曦. 柱前衍生化HPLC法测定齿瓣石斛中总氨基酸的含量[J]. 中国药房，2012，（31）：2927-2930.
[5]陈建文，李钢，蔡晓斌，曹黎明，黄旭明，乐经科. 36例全脑血管造影术的并发症分析及防治[J]. 中西医结合心脑血管病杂志，2012，（04）：498-499.
关键词：铁皮石斛 紫外分光度法 总氨基酸 含量测定
一、引言
铁皮石斛俗称铁皮枫斗，是我国传统名贵中药，民间又称其为“救命仙草”，药界的“大熊猫”，铁皮石斛味甘，性微寒，有生津养胃、滋阴清热、润肺益肾、润喉明目、强腰的功效。现代研究表明铁皮石斛可提高机体免疫力、抗肿瘤、抑制血栓形成、延缓衰老的作用。其有效成分包括氨基酸、多糖等。本实验采用紫外-可见分光光度法（UV）来测定铁皮石斛中氨基酸的含量，为以后铁皮石斛氨基酸的含量测定提供实验实验方法及依据。
二、实验材料
紫外分光度计（日本岛津），恒温干燥箱（DHG-9040A），分析天平（JJ324BC美国双杰电子天平）天冬氨酸对照品购自中国药品生物制品检定所（批号 200711），茚三酮（无锡市展望化工试剂有限公司），CH3COONa（天津博迪化学股份有限公司）所有试剂均为分析纯。铁皮石斛采于福建漳州市、三明市、泉州市、龙岩市、南平市、福州市，经******鉴定为兰科植物铁皮石斛的干燥茎。
三、方法与结果
1.对照品溶液的制备。将天冬氨酸对照品干燥至恒重，精密称取对照品10. 34 mg，配置为1.034mg/ml的对照品储备液。取储备液5ml配置0.1034mg/ml的对照品溶液。
2.供试品溶液的制备。将铁皮石斛粗粉精密称取1.00g，将其置于置具塞锥形瓶中，加入0. 1 mol/L的HCl 溶液20ml，超声提取0.5h后抽滤，滤液用15%的NaOH溶液调至中性并转移至100 m L 量瓶中，加水至刻度即得。
3.检测波长的确定。取2ml天冬氨酸对照品溶液和12ml供试品溶液分别加入各1. 0 m L的 p H为 6. 5的 CH3COONa 缓冲盐溶液和2%茚三酮溶液后进行全波长扫描，确定565为最大吸收波长。
4.标准曲线的绘制。精密移取天冬氨酸对照品溶液 1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4. 0 m L，分别置于25m L 量瓶中，分别补水至4. 0 m L，充分摇匀后置于沸水浴中加热40 min，取出后放冷15 min后加水定容。精密加入显色剂（各1. 0 m L的 p H为 6. 5的 CH3COONa 缓冲盐溶液和2%茚三酮溶液）摇匀，以相应溶剂为空白溶液在 565 nm处测定吸光度，横坐标为天冬氨酸溶液质量浓度，测得的吸光度为纵坐标，得回归方程 Y = 2. 5264X -0. 0579（ r = 0. 9998） 。
5.方法学考察。
5.1精密度试验。精密取2.0ml对照品溶液和12. 0 m L供试品溶液，按2. 4 项下方法于565nm 处重复测定6次吸光度值，结果对照品溶液吸光度RSD值为0.34%，供试品溶液吸光度RSD值为0.67%。试验结果表明该方法的精密度良好。
5.2稳定性试验。精密移取2.0ml对照品溶液和12. 0 m L供试品溶液，按2. 4 项下方法于565nm 分别于 0，10，20，30，40，50min 测定吸光度值，结果对照品溶液吸光度RSD值为2.98%，供试品溶液吸光度RSD值为3.2%。对照品溶液在30min以内的吸光度RSD值为1.67%，供试品溶液在30min以内的吸光度RSD值为2.07%，因此，该显色反应应控制在30min内。
5.3重复性试验。取同一批药材按 2. 2 项下的方法制备供试品溶液，精密移取12. 0 m L供试品溶液，按2. 4 项下方法于565nm 处重复测定6次吸光度值，结果氨基酸质量分数（ 0. 227 ± 0. 004） % ，RSD值为 1. 5% 。试验结果表明该方法的重复性良好。
5.4加样回收率试验。取已知含量的铁皮石斛药材粗粉精密称定2. 0 g，平行称定 6 份，按 2. 2 项下方法制备供试品溶液（氨基酸含量为0. 2486 mg），按 2. 4 项下方法操作并精密加入天冬氨酸对照品0. 24 mg，结果见表1。
四、铁皮石斛含量测定
取不同产地的铁皮石斛粗粉2g，按 2. 2 项下方法制备供试品溶液（氨基酸 含量为0. 2486 mg），按 2. 4 项下方法操作，测定氨基酸含量。结果发现三明市铁皮石斛的氨基酸含量最高。
五、結语
长年无节制采掘导致铁皮石斛的自然繁殖率极低，铁皮石斛的自然资源开始日趋枯竭，目前为止，已基本无野生铁皮石斛资源可用，在 1987 年铁皮石斛作为三级珍稀濒危保护植物被《中国珍稀濒危保护植物名录》收录，同时也作为二类药材品种被野生药材资源保护管理条例》收录。
氨基酸为铁皮石斛的有效成分之一，本实验首先建立铁皮石斛中氨基酸的含量测定方法，结果对照品天冬氨酸线性关系良好，精密度、重复性良好，显色反应在30min内稳定性良好，平均回收率99.27%。其中三明市铁皮石斛的氨基酸含量最高。综上所述，铁皮石斛中氨基酸的含量测定方法重复性、准确性良好，且操作简单，本实验为福建地区铁皮石斛的筛选提供了依据。
参考文献：
[1]鲁芹飞. 铁皮石斛质量评价及干燥工艺研究[D].广州中医药大学，2014.
[2]张亮，鲁芹飞，张扬，徐香琴，徐兰芳，曾毅，黄松. 柱前衍生化RP-HPLC测定铁皮石斛中的氨基酸的含量[J]. 中国实验方剂学杂志，2014，（22）：61-65.
[3]王培培，鲁芹飞，李婧，黄松，陈建南. 铁皮石斛中总氨基酸的含量测定及提取工艺优选[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，（14）：30-33.
[4]李光，李学兰，陈曦. 柱前衍生化HPLC法测定齿瓣石斛中总氨基酸的含量[J]. 中国药房，2012，（31）：2927-2930.
[5]陈建文，李钢，蔡晓斌，曹黎明，黄旭明，乐经科. 36例全脑血管造影术的并发症分析及防治[J]. 中西医结合心脑血管病杂志，2012，（04）：498-499.