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摘要[目的]研究拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达。[方法]构建XCD1原核表达载体，根据NCBI基因序列设计引物，并以PCR扩增得到大量目的片段XCD1，将XCD1连接到原核表达载体pET32a+，并对重组质粒进行测序鉴定，将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21（DE3），对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化。IPTG诱导表达获得目的蛋白，对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化。[结果]XCD1序列全长为1 242 bp，与PCR产物大小一致。蛋白XCD1pET32a+较适表达条件为在30 ℃ 0.1 mmol/L的IPTG誘导1.5 h。[结论]该结果为进一步蛋白纯化及酶活测定试验奠定了基础。
关键词拟南芥（Arabidopsis thaliama）；AtXCD1；重组载体；原核表达
中图分类号S188；Q753文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04197-02
Prokaryotic Expression of Arabidopsis AtXCD1 Fusion Proteins
CHEN Guanglang， CAO Shuqing et al（School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei University of Technology， Hefei， Anhui 230009）
Abstract[Objective] To study prokaryotic expression of Arabidopsis AtXCD1 protein. [Method] To construct the prokaryotic expression plasmid of XCD1， the XCD1 encoding sequence was proliferated by PCR under the direction of the primers designed according to the sequence obtained from NCBI website. Then the cDNA fragments were cloned into prokaryotic expression vectors pET32a+ and sequenced. In addition， recombinant plasmids were transformed into E.coli. BL21 （DE3） for expression. Expression of AtXCD1 was induced to generate their fusion proteins by IPTG， and the protein expression conditions were optimized， such as time， temperature and IPTG concentration. [Result] The whole length of XCD1 sequence is 1 242 bp， the size is the same as PCR products. The proper expression conditions of protein XCD1pET32a+ is 30 ℃ 0.1mmol/L， IPTG induction for 1.5 h. [Conclusion] The study will lay a foundation for further protein purification and enzyme activity determination.
Key wordsArabidopsis； AtXCD1； Recombinant plasmid； Prokaryotic expression
面对日益严重的重金属污染尤其是土壤污染问题，寻找耐受重金属的植物修复基因并阐明其功能机制具有重要的理论及实践意义[1]。镉（Cd）是最具毒性的重金属元素之一，其化合物可溶于水，具有很强的生物迁移性，极易被植物吸收并积累[2]，Cd2+被作物富集吸收进入食物链，进而引起骨质疏松、贫血、高血压以及肾损伤等疾病[3]。很多基因都参与重金属镉的脱毒途径，如AtATM3、AtPCR1、AtPDR8和AtGSH1等[4-6]。实验室对AtXCD1基因的研究发现，当把XCD1基因敲除后，敲除突变体对镉的胁迫表现为敏感，根长鲜重等生理指标都比野生型低。当利用35S过量表达载体获得XCD1过量表达株系，过量表达株系对镉的胁迫表现为耐受，这与敲除突变体的敏感表型相一致。这说明XCD1基因极有可能参与拟南芥对镉的响应调控。
根据拟南芥数据库的基因组序列，XCD1（At3g10890）基因编码一个（1，4）β甘露聚糖内水解酶。β甘露聚糖内水解酶可以将植物体内的甘露聚糖和半纤维素等水解成甘露糖等小分子，甘露糖可能作为信号分子间接调节GSH途径。为了深入研究XCD1基因参与镉耐受的机理，笔者构建XCD1pET32a+重组载体并将其转入原核表达菌株BL21中，探索其合适的表达条件，以期为下一步酶活测定及其他蛋白试验奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 研究对象。野生型拟南芥（Arabidopsis thaliama），记作为（WildType，WT），由美国拟南芥种质资源库提供，后由实验室繁育保存。
1.1.2供试菌株和载体。感受态细胞DH5α、原核表达大肠杆菌菌株BL21和原核表达载体pET32a+，由实验室繁育保存。
1.1.3主要试剂。RNAiso Plus总RNA抽提试剂盒和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒，均购自Fermentas公司；限制性内切酶BamH I和Xho I、T4 DNA连接酶、Easy Taq和BL21感受态细胞等，均购自北京Transgen公司； TIAN Gel MiDi Purification Kit、TIAN quick MiDi Purification Kit和TIAN prep Mini Plasmid kit，均购自天根公司。 1.2方法
1.2.1拟南芥AtXCD1基因克隆。提取拟南芥总RNA，使用反转录试剂盒获得cDNA。根据TAIR网站提供的XCD1基因的CDS序列，结合载体上的酶切位点，使用Primer Premier 5软件设计XCD1两端引物。最终设计获得的引物和酶切位点如下，FP：N N N ggatc cAT GAA GTG TT TGT GTT TTGTCG（BamHⅠ），RP：NNN ctc gag AATTTTAGTTTTTGATAACT TTCCTT（XhoⅠ）。
1.2.2扩增条件。以cDNA为模板，用PrimeSTAR MAX DNA Polymerase高保真酶扩增，扩增条件：98 ℃预变性5 min，98 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循环；72 ℃延伸10 min，25 ℃保存。扩增完成后，制备1%琼脂糖TAE电泳胶，验证产物条带大小是否与目的条带大小相符[7]，若大小相符，用TIANGel MiDi Purification Kit对扩增的基因产物进行纯化。
1.2.3XCD1pET32a+原核表达载体的构建。用LA液体培养基大量扩培含pET32a+载体的大肠杆菌，用TIANprep MiniPlasmid kit提取质粒，并验证大小是否相符。用BamHⅠ和XhoⅠ对纯化好的XCD1基因和pET32a+质粒进行37 ℃双酶切2 h，对酶切产物进行琼脂糖切胶回收，回收后基因和质粒按照5∶1的体积比16 ℃连接过夜。热激转化并涂板，37 ℃倒置培养过夜，挑取单菌落后加入液体培养基扩培，进行菌落PCR。挑取较亮条带对应的菌送测序。若测序成功，即获得重组载体。
1.2.4目的蛋白的诱导表达。将成功转入重组质粒的原核表达菌先37 ℃扩大培养至OD600≈0.6，加入IPTG，再将培养基转至30 ℃环境中诱导培养。设置空白质粒作对照，尝试不同浓度的IPTG诱导量及诱导时间，以确定较适合的诱导条件。取不同处理条件下的原核表达菌1 ml，离心收集沉淀，用PBS洗菌体沉淀2次，加入上样缓冲液，沸水浴5 min，离心取上清，用20 μl进行SDSPAGE电泳分析。
1.2.5SDSPAGE电泳。组装好制胶模具，先灌入适量的12%聚丙烯酰胺分离胶，待其凝固后再灌入5%的浓缩胶，放置加样梳，待浓缩胶凝固，小心取下加样梳，即制好电泳胶。将电泳胶移至电泳槽，加入电泳缓冲液，并上样。先以80 V恒压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后将电压改为120 V恒压，电泳至溴酚蓝指示剂到分离胶底部，停止电泳[8-9]。打开模具，取下电泳胶，置于12 cm玻璃皿中，加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮兰R250 染色液，在水平摇床上摇动染色3 h。倒出染色液后，在平皿中加入适量甲醇脱色液，于水平染色摇床上缓慢摇动，脱色至背景清晰。拍照记录试验结果用于后期分析。
2结果与分析
2.1PCR扩增拟南芥AtXCD1基因以拟南芥总RNA反转录的cDNA作为模板，加入设计好的XCD1序列两端引物及其他试剂，扩增目的片段。电泳结果如图1所示，XCD1序列全长为1 242 bp，与PCR产物大小一致。同时，提取了pET32a+质粒，电泳检测证明大小合适。
图1PCR产物及质粒检测2.2目的基因与质粒的酶切连接转化及阳性验证挑取单菌落进行菌液PCR，结果如图2所示，2号菌和3号菌为阳性菌，大小与目的条带一致。
图2菌落PCR结果2.3目的蛋白的表达条件优化为使目的蛋白在原核菌株中具有较合适的表达条件，分别对诱导时间、诱导温度及诱导剂浓度进行探索。图3中ABC综合分析确定，蛋白表达的影响。
图3目的蛋白表达条件的优化
3结论与讨论
试验主要介绍了XCD1pET32a+重组载体的构建和其在原核细胞中的诱导表达及合适诱导表达条件的探索等问题，最终确定蛋白XCD1pET32a+在30 ℃ 0.1 mmol/L的IPTG诱导1.5 h为较适表达条件，为下一步酶活测定及蛋白纯化等试验奠定了基础。随着一些抗逆基因的鉴定和抗逆机理不断被深入研究，利用转基因技术将外源抗逆基因导入植物基因组，在提高植物抗逆性、改良农作物遗传性状及培育农作物优良品系等方面具有广阔的应用前景及经济价值[10]。
参考文献
[1] CLAUDIA JONAS，HIROFUMI NAKAGAMI，HERIBERT HIRT.Activation of distinct mitogenactivated protein kinase pathways by Copper and Cadmium[J].Plant Physiology，2004，136：3276-3283.
[2] SHEORAN I S.Effect of cadmium and nicked on photosynthesis and the enzymes of the photosynthetic carbon reduction cycle in pigeonpea[J].Photosynthesis Research，1990，23：345-351.
[3] 侯文胜，郭三堆，路明，等.利用转基因技术进行植物遗传改良[J].生物技术通报，2002（1）：10-15.
[4] 吴福彪.基因工程与植物的遗传改良[J].生物学通报，2010，45（5）：7-10.
[5] LOZANORODRIGUEZ E，HEMANDEZ L E，BONAY P，et al.Distribution of cadmiumin shoot and root tissues of maize and pea plants：physiological disturbances[J].Journal of Experimental Botany，1997，48：123-128.
[6] NISHIZONO H，ICHIKAWA H，SUZIKI S，et al.The role of the root cell wall in the heavy metal tolerance of Athyrium yokoscense[J].Plant and Soil，1987，101：15-20.
[7] 吕申超，王海涛，鱼斌，等.拟南芥HIS13基因克隆及表达载体构建[J].合肥工业大学学报，2012（1）：120-123.
[8] CLAUDIA JONAK，HIROFUMI NAKAGAMI，HERIBERT HIRT.Heavy Metal Stress Activation of Distinct MitogenActivated Protein Kinase Pathways by Copper and Cadmium[J].Plant Physiology，2004，136：3276-3283.
[9] SAMBROOK J，RUSSELL D W.分子克隆实验指南[M].黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等，译.3版.北京：科学出版社，2002：26-395.
[10] 杜李继，顾菊，陈光朗，等.拟南芥AtMYB50和AtMYB61蛋白的原核表达研究[J].合肥工业大学学报，2014（1）：105-109.
关键词拟南芥（Arabidopsis thaliama）；AtXCD1；重组载体；原核表达
中图分类号S188；Q753文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04197-02
Prokaryotic Expression of Arabidopsis AtXCD1 Fusion Proteins
CHEN Guanglang， CAO Shuqing et al（School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei University of Technology， Hefei， Anhui 230009）
Abstract[Objective] To study prokaryotic expression of Arabidopsis AtXCD1 protein. [Method] To construct the prokaryotic expression plasmid of XCD1， the XCD1 encoding sequence was proliferated by PCR under the direction of the primers designed according to the sequence obtained from NCBI website. Then the cDNA fragments were cloned into prokaryotic expression vectors pET32a+ and sequenced. In addition， recombinant plasmids were transformed into E.coli. BL21 （DE3） for expression. Expression of AtXCD1 was induced to generate their fusion proteins by IPTG， and the protein expression conditions were optimized， such as time， temperature and IPTG concentration. [Result] The whole length of XCD1 sequence is 1 242 bp， the size is the same as PCR products. The proper expression conditions of protein XCD1pET32a+ is 30 ℃ 0.1mmol/L， IPTG induction for 1.5 h. [Conclusion] The study will lay a foundation for further protein purification and enzyme activity determination.
Key wordsArabidopsis； AtXCD1； Recombinant plasmid； Prokaryotic expression
面对日益严重的重金属污染尤其是土壤污染问题，寻找耐受重金属的植物修复基因并阐明其功能机制具有重要的理论及实践意义[1]。镉（Cd）是最具毒性的重金属元素之一，其化合物可溶于水，具有很强的生物迁移性，极易被植物吸收并积累[2]，Cd2+被作物富集吸收进入食物链，进而引起骨质疏松、贫血、高血压以及肾损伤等疾病[3]。很多基因都参与重金属镉的脱毒途径，如AtATM3、AtPCR1、AtPDR8和AtGSH1等[4-6]。实验室对AtXCD1基因的研究发现，当把XCD1基因敲除后，敲除突变体对镉的胁迫表现为敏感，根长鲜重等生理指标都比野生型低。当利用35S过量表达载体获得XCD1过量表达株系，过量表达株系对镉的胁迫表现为耐受，这与敲除突变体的敏感表型相一致。这说明XCD1基因极有可能参与拟南芥对镉的响应调控。
根据拟南芥数据库的基因组序列，XCD1（At3g10890）基因编码一个（1，4）β甘露聚糖内水解酶。β甘露聚糖内水解酶可以将植物体内的甘露聚糖和半纤维素等水解成甘露糖等小分子，甘露糖可能作为信号分子间接调节GSH途径。为了深入研究XCD1基因参与镉耐受的机理，笔者构建XCD1pET32a+重组载体并将其转入原核表达菌株BL21中，探索其合适的表达条件，以期为下一步酶活测定及其他蛋白试验奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 研究对象。野生型拟南芥（Arabidopsis thaliama），记作为（WildType，WT），由美国拟南芥种质资源库提供，后由实验室繁育保存。
1.1.2供试菌株和载体。感受态细胞DH5α、原核表达大肠杆菌菌株BL21和原核表达载体pET32a+，由实验室繁育保存。
1.1.3主要试剂。RNAiso Plus总RNA抽提试剂盒和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒，均购自Fermentas公司；限制性内切酶BamH I和Xho I、T4 DNA连接酶、Easy Taq和BL21感受态细胞等，均购自北京Transgen公司； TIAN Gel MiDi Purification Kit、TIAN quick MiDi Purification Kit和TIAN prep Mini Plasmid kit，均购自天根公司。 1.2方法
1.2.1拟南芥AtXCD1基因克隆。提取拟南芥总RNA，使用反转录试剂盒获得cDNA。根据TAIR网站提供的XCD1基因的CDS序列，结合载体上的酶切位点，使用Primer Premier 5软件设计XCD1两端引物。最终设计获得的引物和酶切位点如下，FP：N N N ggatc cAT GAA GTG TT TGT GTT TTGTCG（BamHⅠ），RP：NNN ctc gag AATTTTAGTTTTTGATAACT TTCCTT（XhoⅠ）。
1.2.2扩增条件。以cDNA为模板，用PrimeSTAR MAX DNA Polymerase高保真酶扩增，扩增条件：98 ℃预变性5 min，98 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循环；72 ℃延伸10 min，25 ℃保存。扩增完成后，制备1%琼脂糖TAE电泳胶，验证产物条带大小是否与目的条带大小相符[7]，若大小相符，用TIANGel MiDi Purification Kit对扩增的基因产物进行纯化。
1.2.3XCD1pET32a+原核表达载体的构建。用LA液体培养基大量扩培含pET32a+载体的大肠杆菌，用TIANprep MiniPlasmid kit提取质粒，并验证大小是否相符。用BamHⅠ和XhoⅠ对纯化好的XCD1基因和pET32a+质粒进行37 ℃双酶切2 h，对酶切产物进行琼脂糖切胶回收，回收后基因和质粒按照5∶1的体积比16 ℃连接过夜。热激转化并涂板，37 ℃倒置培养过夜，挑取单菌落后加入液体培养基扩培，进行菌落PCR。挑取较亮条带对应的菌送测序。若测序成功，即获得重组载体。
1.2.4目的蛋白的诱导表达。将成功转入重组质粒的原核表达菌先37 ℃扩大培养至OD600≈0.6，加入IPTG，再将培养基转至30 ℃环境中诱导培养。设置空白质粒作对照，尝试不同浓度的IPTG诱导量及诱导时间，以确定较适合的诱导条件。取不同处理条件下的原核表达菌1 ml，离心收集沉淀，用PBS洗菌体沉淀2次，加入上样缓冲液，沸水浴5 min，离心取上清，用20 μl进行SDSPAGE电泳分析。
1.2.5SDSPAGE电泳。组装好制胶模具，先灌入适量的12%聚丙烯酰胺分离胶，待其凝固后再灌入5%的浓缩胶，放置加样梳，待浓缩胶凝固，小心取下加样梳，即制好电泳胶。将电泳胶移至电泳槽，加入电泳缓冲液，并上样。先以80 V恒压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后将电压改为120 V恒压，电泳至溴酚蓝指示剂到分离胶底部，停止电泳[8-9]。打开模具，取下电泳胶，置于12 cm玻璃皿中，加入5倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮兰R250 染色液，在水平摇床上摇动染色3 h。倒出染色液后，在平皿中加入适量甲醇脱色液，于水平染色摇床上缓慢摇动，脱色至背景清晰。拍照记录试验结果用于后期分析。
2结果与分析
2.1PCR扩增拟南芥AtXCD1基因以拟南芥总RNA反转录的cDNA作为模板，加入设计好的XCD1序列两端引物及其他试剂，扩增目的片段。电泳结果如图1所示，XCD1序列全长为1 242 bp，与PCR产物大小一致。同时，提取了pET32a+质粒，电泳检测证明大小合适。
图1PCR产物及质粒检测2.2目的基因与质粒的酶切连接转化及阳性验证挑取单菌落进行菌液PCR，结果如图2所示，2号菌和3号菌为阳性菌，大小与目的条带一致。
图2菌落PCR结果2.3目的蛋白的表达条件优化为使目的蛋白在原核菌株中具有较合适的表达条件，分别对诱导时间、诱导温度及诱导剂浓度进行探索。图3中ABC综合分析确定，蛋白表达的影响。
图3目的蛋白表达条件的优化
3结论与讨论
试验主要介绍了XCD1pET32a+重组载体的构建和其在原核细胞中的诱导表达及合适诱导表达条件的探索等问题，最终确定蛋白XCD1pET32a+在30 ℃ 0.1 mmol/L的IPTG诱导1.5 h为较适表达条件，为下一步酶活测定及蛋白纯化等试验奠定了基础。随着一些抗逆基因的鉴定和抗逆机理不断被深入研究，利用转基因技术将外源抗逆基因导入植物基因组，在提高植物抗逆性、改良农作物遗传性状及培育农作物优良品系等方面具有广阔的应用前景及经济价值[10]。
参考文献
[1] CLAUDIA JONAS，HIROFUMI NAKAGAMI，HERIBERT HIRT.Activation of distinct mitogenactivated protein kinase pathways by Copper and Cadmium[J].Plant Physiology，2004，136：3276-3283.
[2] SHEORAN I S.Effect of cadmium and nicked on photosynthesis and the enzymes of the photosynthetic carbon reduction cycle in pigeonpea[J].Photosynthesis Research，1990，23：345-351.
[3] 侯文胜，郭三堆，路明，等.利用转基因技术进行植物遗传改良[J].生物技术通报，2002（1）：10-15.
[4] 吴福彪.基因工程与植物的遗传改良[J].生物学通报，2010，45（5）：7-10.
[5] LOZANORODRIGUEZ E，HEMANDEZ L E，BONAY P，et al.Distribution of cadmiumin shoot and root tissues of maize and pea plants：physiological disturbances[J].Journal of Experimental Botany，1997，48：123-128.
[6] NISHIZONO H，ICHIKAWA H，SUZIKI S，et al.The role of the root cell wall in the heavy metal tolerance of Athyrium yokoscense[J].Plant and Soil，1987，101：15-20.
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[9] SAMBROOK J，RUSSELL D W.分子克隆实验指南[M].黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等，译.3版.北京：科学出版社，2002：26-395.
[10] 杜李继，顾菊，陈光朗，等.拟南芥AtMYB50和AtMYB61蛋白的原核表达研究[J].合肥工业大学学报，2014（1）：105-109.