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摘要：目的：建立一种简便、快速的高效液相色谱法测定壮骨健膝颗粒的指标成分士的宁的含量。方法：采用色谱拄为Kromasil C18柱，甲醇—1％冰醋酸溶液一三乙胺(23:77:0.4)为流动相，流速为1.0mL／min，柱温为室温，检测波长为260nm。结果：在浓度为30.5μg～122.0μg／mL范围内具有良好的线性关系，A=21029C--157590(r=0，9998，n=5)，方法回收率为101.7％，RSD为0.67％。结论：该方法简单，精确，灵敏度高，重现性好，可用于壮骨健膝颗粒的质量控制。
关键词：壮骨健膝颗粒；士的宁；高效液相色谱；含量测定
中图分类号：R927.2 文献标识码：A
文章编号：1007--2349(2009)09--0063--02
壮骨健膝颗粒由桑寄生、川牛膝、白芍、马钱子粉等药材配伍组成。主要作用为补肝肾，强筋骨，祛风湿，活血。马钱子中的士的宁为其有效成分，但毒性剧烈，其含量高低是引起马钱子中毒的主要原因，所以选择士的宁作为含量控制的指标，采用高效液相色谱法测定壮骨健膝颗粒中士的宁的含量，该方法可靠、灵敏、快速。
1 仪器与试药
1，1仪器LC—10ATvp液相色谱仪，SPD一10AvpUV—VIS检测器(日本岛津)；ODSClg柱(5μm，200mm×4.6mm，北京迪马公司)，微量进样器(50μL，上海高鸽工贸有限公司)，ANASTAR色谱数据处理系统(suntex)；电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，微孔滤膜(0.45μm，有机相)。
1，2试药 士的宁化学对照品(中国药品生物制品检定所，批号110705--200306)；甲醇(禹王集团，批号20070206072，色谱纯)；氨水(上海久亿化学试剂有限公司，批号：20070101，分析纯)；氯仿(上海试剂总厂，批号20050217，分析纯)；冰醋酸(中国上海试剂总厂，批号2004022，分析纯)；甲醇(中国上海试剂总厂，批号20050217，分析纯)；壮骨健膝颗粒(批号20061201，20061203，20061204)。
2 方法与结果
2，1色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇一1％冰醋酸溶液一三乙胺(23:77:O.4)为流动相；流速1.0mL／min；温度为室温；检测波长为260nm。
2，2对照品溶液的制备
精密称取士的宁化学对照品约6mg，置10mL容量瓶中，加氯仿适量使溶解并稀释到刻度，摇匀摇匀作为储备液。精密移取0.5mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2，3供试品溶液的制备精密称定本品粉末约5g，放入具塞锥形瓶内，加氢氧化钠2mL，放置30min，精密加入氯仿18mL，密塞称重，水浴回流2h，放冷，称重，用氯仿补足重量，提取液过少量无水硫酸钠的滤纸，取续滤液，精密移取续滤液5mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2，4阴性对照溶液的制备按壮骨健膝颗粒处方及工艺，制备不含马钱子的阴性样品。取阴性样品，照供试品溶液制备方法操作，制备阴性对照溶液。
分别吸取士的宁对照品溶液供试品溶液与阴性对照溶液各20uL注入液相色谱仪。结果表明，在上述色谱条件下黄士的宁与其他成分分离良好，阴性对照溶液与供试品溶液比较，相应位置未出峰，认为无干扰，见图1～3。
2，5线性关系考察分别精密量取2，2项中对照品溶液储备液0.5mL、1.0mL、1.2mL、1.5mL、1.8mL、2.0mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制备成浓度依次为30.5μg／mL，61，0μg／mL，73的宁2μg／mL，91，Sμg／mL，109，8μg／mL，122.0μg／mL的对照品溶液。按2.1项下的色谱条件，分别进样20μL，记录色谱图，以峰面积(A)对浓度(C)线性回归，求得回归方程为A=21029C—157590，(r=0.9998，n＝5)，士的宁在30.5～122.Oμg／mL浓度范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
2，6精密度试验精密吸取士的宁对照品溶液20μL连续进样6次，以峰面积计算，结果其RSD为2.7％。
2，7重复性试验按上述供试品溶液制备方法，称取同批号样品(批号20061201)6份，分别测定士的宁的峰面积，并计算其含量。结果平均含量为91.24μg／g，RSD为0.7％。
2，8供试品稳定性试验取2.3项下供试品溶液，分别于0、1、2、4、8和24h进样，测定士的宁的峰面积，结果计算RSD一3.3％，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.9回收率试验采用加样回收法，分别精密称取已知含量的样品(批号20061201)适量(共7份)，约5g，往第一份中加2mL氨水，18mL氯仿，余下的6份分别精密加入1mL浓度为109.8μg／mL的士的宁标准品，2mL氨水，17mL氯仿。取浓度为30.5μg／mL的标准品做对照。分别进样20μL，记录峰面积，并计算回收率，结果士的宁的平均回收率为101.7％，RSD为0.67％，结果见表1。
2，10样品含量测定分别取不同批号的壮骨健膝颗粒，精密称定，按上述样品溶液制备方法和色谱条件测定峰面积积分值，结果见表2。
3 讨论
士的宁为马钱子的主要成分，约占总生物碱的45％，马钱子碱的药效只有士的宁的14％。但士的宁毒性剧烈，其含量高低是引起马钱子中毒的主要原因故对士的宁进行含量测定。
用HPLC法测定士的宁含量时，流动相甲醇：1％醋酸：三乙胺以23:77:0.4的比例时，士的宁的出峰时间不至于过长或过短，且分离效果较好。
HPLC法操作简便，分离度好，准确度高，重现性好，回收率高，可作为壮骨健膝颗粒中士的宁的含量的测定方法，为壮骨健膝颗粒的质量控制提供了可靠的依据。
关键词：壮骨健膝颗粒；士的宁；高效液相色谱；含量测定
中图分类号：R927.2 文献标识码：A
文章编号：1007--2349(2009)09--0063--02
壮骨健膝颗粒由桑寄生、川牛膝、白芍、马钱子粉等药材配伍组成。主要作用为补肝肾，强筋骨，祛风湿，活血。马钱子中的士的宁为其有效成分，但毒性剧烈，其含量高低是引起马钱子中毒的主要原因，所以选择士的宁作为含量控制的指标，采用高效液相色谱法测定壮骨健膝颗粒中士的宁的含量，该方法可靠、灵敏、快速。
1 仪器与试药
1，1仪器LC—10ATvp液相色谱仪，SPD一10AvpUV—VIS检测器(日本岛津)；ODSClg柱(5μm，200mm×4.6mm，北京迪马公司)，微量进样器(50μL，上海高鸽工贸有限公司)，ANASTAR色谱数据处理系统(suntex)；电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，微孔滤膜(0.45μm，有机相)。
1，2试药 士的宁化学对照品(中国药品生物制品检定所，批号110705--200306)；甲醇(禹王集团，批号20070206072，色谱纯)；氨水(上海久亿化学试剂有限公司，批号：20070101，分析纯)；氯仿(上海试剂总厂，批号20050217，分析纯)；冰醋酸(中国上海试剂总厂，批号2004022，分析纯)；甲醇(中国上海试剂总厂，批号20050217，分析纯)；壮骨健膝颗粒(批号20061201，20061203，20061204)。
2 方法与结果
2，1色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇一1％冰醋酸溶液一三乙胺(23:77:O.4)为流动相；流速1.0mL／min；温度为室温；检测波长为260nm。
2，2对照品溶液的制备
精密称取士的宁化学对照品约6mg，置10mL容量瓶中，加氯仿适量使溶解并稀释到刻度，摇匀摇匀作为储备液。精密移取0.5mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2，3供试品溶液的制备精密称定本品粉末约5g，放入具塞锥形瓶内，加氢氧化钠2mL，放置30min，精密加入氯仿18mL，密塞称重，水浴回流2h，放冷，称重，用氯仿补足重量，提取液过少量无水硫酸钠的滤纸，取续滤液，精密移取续滤液5mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2，4阴性对照溶液的制备按壮骨健膝颗粒处方及工艺，制备不含马钱子的阴性样品。取阴性样品，照供试品溶液制备方法操作，制备阴性对照溶液。
分别吸取士的宁对照品溶液供试品溶液与阴性对照溶液各20uL注入液相色谱仪。结果表明，在上述色谱条件下黄士的宁与其他成分分离良好，阴性对照溶液与供试品溶液比较，相应位置未出峰，认为无干扰，见图1～3。
2，5线性关系考察分别精密量取2，2项中对照品溶液储备液0.5mL、1.0mL、1.2mL、1.5mL、1.8mL、2.0mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制备成浓度依次为30.5μg／mL，61，0μg／mL，73的宁2μg／mL，91，Sμg／mL，109，8μg／mL，122.0μg／mL的对照品溶液。按2.1项下的色谱条件，分别进样20μL，记录色谱图，以峰面积(A)对浓度(C)线性回归，求得回归方程为A=21029C—157590，(r=0.9998，n＝5)，士的宁在30.5～122.Oμg／mL浓度范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
2，6精密度试验精密吸取士的宁对照品溶液20μL连续进样6次，以峰面积计算，结果其RSD为2.7％。
2，7重复性试验按上述供试品溶液制备方法，称取同批号样品(批号20061201)6份，分别测定士的宁的峰面积，并计算其含量。结果平均含量为91.24μg／g，RSD为0.7％。
2，8供试品稳定性试验取2.3项下供试品溶液，分别于0、1、2、4、8和24h进样，测定士的宁的峰面积，结果计算RSD一3.3％，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.9回收率试验采用加样回收法，分别精密称取已知含量的样品(批号20061201)适量(共7份)，约5g，往第一份中加2mL氨水，18mL氯仿，余下的6份分别精密加入1mL浓度为109.8μg／mL的士的宁标准品，2mL氨水，17mL氯仿。取浓度为30.5μg／mL的标准品做对照。分别进样20μL，记录峰面积，并计算回收率，结果士的宁的平均回收率为101.7％，RSD为0.67％，结果见表1。
2，10样品含量测定分别取不同批号的壮骨健膝颗粒，精密称定，按上述样品溶液制备方法和色谱条件测定峰面积积分值，结果见表2。
3 讨论
士的宁为马钱子的主要成分，约占总生物碱的45％，马钱子碱的药效只有士的宁的14％。但士的宁毒性剧烈，其含量高低是引起马钱子中毒的主要原因故对士的宁进行含量测定。
用HPLC法测定士的宁含量时，流动相甲醇：1％醋酸：三乙胺以23:77:0.4的比例时，士的宁的出峰时间不至于过长或过短，且分离效果较好。
HPLC法操作简便，分离度好，准确度高，重现性好，回收率高，可作为壮骨健膝颗粒中士的宁的含量的测定方法，为壮骨健膝颗粒的质量控制提供了可靠的依据。