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摘要：目的 研究不同纯度高良姜素对人黑色素瘤细胞-人永生化角质形成细胞（A375-HaCaT）共培养模型中黑素细胞增殖及黑素合成的影响。方法 利用Transwell技术建立A375-HaCaT共培养体系，以0.1、0.5、1.0、5.0、10 μg/mL纯度为70%和90%的高良姜素作用于共培养模型。采用MTT比色法检测细胞增殖，NaOH裂解法测定黑素含量，多巴氧化法测定酪氨酸酶活性，ELISA法检测HaCaT细胞因子干细胞生长因子（SCF）、内皮素（ET）-1的表达。结果 A375-HaCaT共培养模型中的A375细胞生长良好，0.1、0.5、1.0、5.0、10 μg/mL纯度为70%和90%的高良姜素对共培养体系中的A375细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成均具有上调作用。各纯度高良姜素浓度≥0.5 μg/mL时，能够提高HaCaT细胞中的ET-1和SCF等细胞因子的表达水平，且纯度70%的高良姜素作用强度优于90%的高良姜素。结论 高良姜素能显著促进A375-HaCaT共培养模型中A375的细胞增殖及黑素合成，其作用机制可能与高良姜素上调HaCaT细胞中的ET-1和SCF等细胞因子的表达水平有关。
关键词：高良姜素；黑色素瘤细胞；角质形成细胞；共培养模型；细胞增殖；黑素；内皮素
白癜风是一种色素障碍性疾病，表现为皮肤脱色而影响美容。由于该病多发于皮肤暴露部位，常给患者带来巨大的心理压力，故一直是皮肤科领域的研究热点。维吾尔医在治疗白癜风方面拥有丰富的诊疗经验。高良姜是维医治疗白癜风常用药驱白巴布期片中的一味主药，以往药理学研究表明，该药具有胃肠道调节作用、平滑肌解痉挛作用、免疫调节作用、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌等多种药理活性[1]。近年来，本课题组通过体内外药效筛选模型确定高良姜总黄酮对白癜风具有良好治疗作用[2]。目前，关于高良姜黄酮类成分高良姜素（Galangin，GL）对人黑色素瘤细胞-人永生化角质形成细胞（A375-HaCaT）共培养体系的作用研究未见报道。因此，本研究拟通过Transwell小室建立A375-HaCaT共培养模型，研究不同纯度、不同浓度的GL对共培养模型中的A375细胞增殖及黑素合成的影响，为高良姜治疗白癜风的新药研制及临床合理用药提供实验依据。
1 实验材料
1.1 药物
GL由新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所基础医学研究室从植物高良姜中分离纯化，化学结构经核磁共振波谱法和质谱法确认，高效液相色谱面积归一化法鉴定其纯度为70%和90%。
1.2 细胞株
人黑色素瘤细胞株A375细胞购自中国科学院细胞库，人永生化角质形成细胞株HaCaT购自中国典型培养物保藏中心。
1.3 主要试剂
氨苄青霉素钠和硫酸链霉素（Amersco产品）， DMEM高糖培养基（GIBCO产品），胎牛血清（Hyclone产品），二甲基亚砜（DMSO）、Triton-X100、L-Dopa、MTT、胰蛋白酶（Sigma产品），干细胞生长因子（SCF）、内皮素（ET）-1试剂盒（南京建成生物工程研究所产品）。
1.4 主要仪器
YJ-875超净工作台（江苏苏净集团），37XB倒置显微镜（上海光学六厂），MCO-18AIC CO2培养箱（Sanyo）， Multiskan Go 1510酶标仪（Thermo Fisher）。
2 实验方法
2.1 A375-HaCaT细胞共培养体系的建立与细胞给药
将处于对数生长期的A375细胞以0.25%胰酶消化，DMEM培养基稀释细胞浓度至5×104个/mL，均匀铺于24孔板。然后将Transwell小室（孔径3 μm，直径12 mm）置于24孔板中，使小室的底部能够接触到黑素细胞培养基。胰酶消化HaCaT细胞，亦用DMEM培养基稀释HaCaT浓度至1.5×105个/mL，转入Transwell小室孔中，每孔1 mL，共培养48 h后，分组给药。分别设定空白对照组、阳性药甲氧沙林（8-MOP）组、70%GL组、90%GL组。其中，空白组加入不含血清的DMEM培养基，其余各组均加入无血清药液，配制浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10 μg/mL。各给药组作用24 h后，于显微镜下观察细胞形态并拍照。
2.2 A375细胞增殖检测
细胞接种于24孔培养板培养48 h，经上述方法处理后加入MTT，继续培养4 h，吸弃培养液，加入DMSO震荡溶解后，于酶标仪测定490 nm处吸光度值。
2.3 A375细胞黑素含量检测
A375-HaCaT细胞共培养48 h后，经药物作用后，移去Transwell小室，并吸弃培养基，用PBS洗涤2次。每孔加入1 mol/L的NaOH 500 μL，37 ℃培养箱放置48 h，于酶标仪405 nm测定吸光度值，黑素含量以给药组A405/正常对照组A405×100%表示。
2.4 A375细胞酪氨酸酶激活率检测
药物作用共培养细胞24 h后，弃去培养液，用PBS洗涤2次，每孔加入1%Triton X-100溶液100 μL，迅速置于-80 ℃冰箱 30 min，随后室温融化使细胞完全裂解。然后加入0.25% L-Dopa溶液10 μL/孔，37 ℃培养箱放置2 h，于酶标仪490 nm测定吸光度值。酪氨酸酶激活率以给药组A490/正常对照组A490×100%表示。
2.5 HaCaT细胞干细胞生长因子和内皮素-1检测
A375-HaCaT共培养细胞经药物作用24 h后，从Transwell小室收集细胞上清液，用于测定ET-1和SCF含量。在96孔酶标板的2～11孔中依次加入不同浓度的标准品溶液50 μL，每个浓度重复2孔。在第1孔加入50 μL样品稀释液，其余从12～96孔加入40 μL 样品稀释液和10 μL血清，每个血清样品重复3孔。封膜板封板置于37 ℃温育30 min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。然后每孔加入50 μL酶标试剂，第1孔除外（空白孔）。37 ℃温育30 min、洗涤液洗涤5次，拍干。每孔加入50 μL显色剂A和50 μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应15 min。以第1孔作为空白调零孔，450 nm测定吸光度值。 3 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。数据用—x±s表示，采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 A375-HaCaT细胞共培养体系
HaCaT细胞正常贴壁培养后呈现多角形、团块状。A375细胞呈梭形、双极、三极或多分支树突状。A375︰HaCaT以1︰3的比例通过Transwell小室共培48 h后，A375细胞生长布满24孔板，且细胞形态无明显变化。见图1。
4.2 不同纯度高良姜素对共培养A375细胞增殖影响
与0 ?g/mL浓度组比较，A375-HaCaT共培养体系经不同浓度8-MOP、90%GL、70%GL作用后，其A375细胞增殖均表现为上升，且增殖程度呈现浓度依赖性。但在相同浓度作用下，70%GL较90%GL对A375细胞的促增殖率高。见表1。
4.3 不同纯度高良姜素对共培养A375细胞黑素及酪氨酸酶的影响
与0 ?g/mL浓度组比较，经0.1、0.5、1.0、5.0、10 μg/mL纯度为70%GL和90%GL作用24 h后，A375细胞的黑素含量及酪氨酸酶活性均有增强。当药物浓度≥0.5 μg/mL时，70%GL对A375细胞黑素含量的上调程度明显高于90% GL。而在相同浓度作用下，70% GL也较之90% GL对A375细胞酪氨酸酶激活率高，此外，纯度为70% GL在0.5 μg/mL时对A375细胞酪氨酸酶活性的上调作用最强。见表2。
4.4 不同纯度高良姜素对共培养HaCaT细胞干细胞生长因子、内皮素-1的影响
当药物浓度≥0.5 μg/mL时，纯度为70%和90%的GL对A375细胞的ET-1细胞因子表达具有显著上调作用，但在相同浓度作用下，70%GL较90%GL的上调作用稍强。此外，纯度90%的GL对A375细胞中SCF细胞因子的水平影响不显著，而70%GL在浓度≥0.5 μg/mL时，其对A375细胞SCF细胞因子的上调作用较显著。见表3。
5 讨论
GL是高良姜的有效药用成分，其对单独培养的A375细胞增殖、黑素合成及酪氨酸酶活性的促进作用已得到证实[4]。而本实验中用A375细胞与HaCaT共培养模型，将不同纯度的GL作用于此模型，结果显示，给药浓度从0.1 μg/mL起，纯度70% GL和90% GL均能促进共培养体系中A375细胞增殖，且随着给药浓度增加，其促增殖程度也愈强。此外，纯度为70% GL对A375细胞促增殖强度也明显优于90% GL，提示高良姜治疗白癜风的有效成分并非仅GL这一单独黄酮类成分，可能还有其他黄酮成分发挥作用。
黑素细胞是黑素合成的场所，但大量的研究资料表明，角质形成细胞对黑素细胞增殖及黑素合成具有重要影响[3-4]。黑素细胞位于表皮基底层，每个与其毗邻约36个角质形成细胞在形态和功能上密切关联，构成“表皮黑素单元”。许多学者曾用培养的黑素细胞或黑素瘤细胞来验证对于黑素生成有潜在影响的化合物的作用，但在皮肤和毛发中，黑素细胞与邻近细胞间的相互作用不容忽视，故黑素细胞-角质形成细胞共培养是一种更好的白癜风药物检测模型。目前黑素细胞-角质形成细胞共培养被广泛应用于研究黑素细胞与角质形成细胞的相互作用、色素的转移机制、移植治疗白癜风、筛选和验证药物等方面。近年来研究发现， 角质形成细胞可通过分泌多种细胞因子及与黑素细胞的接触而对黑素细胞的生物学性状产生显著影响。角质形成细胞细胞所表达的碱性成纤维细胞生长因子、SCF、ET、白三烯等均能直接作用于黑素细胞，促进其增殖并合成黑色素[5]。本研究结果表明，0.1、0.5、1.0、5.0、10 μg/mL的GL均能够不同程度地促进A375细胞黑素合成、提高酪氨酸酶活性。此外，其对HaCaT细胞中ET-1和SCF细胞因子的表达具有显著上调作用，这可能是导致GL提高A375细胞酪氨酸酶活性，进而促进黑素合成的内在原因。而在相同药物浓度作用下，70%GL较之90%GL对A375细胞的作用强。这与GL对A375细胞增殖的作用趋势一致，进一步证明高良姜治疗白癜风的有效成分除GL以外还包括其他黄酮类成分。
综上所述，GL能够显著促进A375-HaCaT共培养体系中A375细胞增殖，提高细胞中黑素含量及酪氨酸酶活性。其药物作用机制可能与HaCaT细胞中ET-1和SCF细胞因子的表达升高有关。此外，实验结果表明，在筛选高良姜治疗白癜风的有效成分过程中，GL并非纯度越高药效作用越好。不同纯度GL的药效作用研究为高良姜治疗白癜风的新药研制及临床合理用药奠定了基础。
参考文献：
[1] 胡佳惠，闫明.高良姜的研究进展[J].时珍国医国药，2009，20（10）：2544-2546.
[2] 闫明，霍仕霞，高莉，等.高良姜有效部位在制备治疗白癜风的药物的用途：中国，201010122088.6[P].2011-11-30.
[3] Tomohisa Hirobe. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes[J]. Pigment Cell Res，2004，18：2-12.
[4] 胡晋红，朱全刚.皮肤药理学[M].北京：化学工业出版社，2008：46-50.
[5] 张迪敏，李永伟，许爱娥.黑素细胞与角质形成细胞共培养的应用进展[J].中国美容医学，2005，14（2）：236-238.
关键词：高良姜素；黑色素瘤细胞；角质形成细胞；共培养模型；细胞增殖；黑素；内皮素
白癜风是一种色素障碍性疾病，表现为皮肤脱色而影响美容。由于该病多发于皮肤暴露部位，常给患者带来巨大的心理压力，故一直是皮肤科领域的研究热点。维吾尔医在治疗白癜风方面拥有丰富的诊疗经验。高良姜是维医治疗白癜风常用药驱白巴布期片中的一味主药，以往药理学研究表明，该药具有胃肠道调节作用、平滑肌解痉挛作用、免疫调节作用、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌等多种药理活性[1]。近年来，本课题组通过体内外药效筛选模型确定高良姜总黄酮对白癜风具有良好治疗作用[2]。目前，关于高良姜黄酮类成分高良姜素（Galangin，GL）对人黑色素瘤细胞-人永生化角质形成细胞（A375-HaCaT）共培养体系的作用研究未见报道。因此，本研究拟通过Transwell小室建立A375-HaCaT共培养模型，研究不同纯度、不同浓度的GL对共培养模型中的A375细胞增殖及黑素合成的影响，为高良姜治疗白癜风的新药研制及临床合理用药提供实验依据。
1 实验材料
1.1 药物
GL由新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所基础医学研究室从植物高良姜中分离纯化，化学结构经核磁共振波谱法和质谱法确认，高效液相色谱面积归一化法鉴定其纯度为70%和90%。
1.2 细胞株
人黑色素瘤细胞株A375细胞购自中国科学院细胞库，人永生化角质形成细胞株HaCaT购自中国典型培养物保藏中心。
1.3 主要试剂
氨苄青霉素钠和硫酸链霉素（Amersco产品）， DMEM高糖培养基（GIBCO产品），胎牛血清（Hyclone产品），二甲基亚砜（DMSO）、Triton-X100、L-Dopa、MTT、胰蛋白酶（Sigma产品），干细胞生长因子（SCF）、内皮素（ET）-1试剂盒（南京建成生物工程研究所产品）。
1.4 主要仪器
YJ-875超净工作台（江苏苏净集团），37XB倒置显微镜（上海光学六厂），MCO-18AIC CO2培养箱（Sanyo）， Multiskan Go 1510酶标仪（Thermo Fisher）。
2 实验方法
2.1 A375-HaCaT细胞共培养体系的建立与细胞给药
将处于对数生长期的A375细胞以0.25%胰酶消化，DMEM培养基稀释细胞浓度至5×104个/mL，均匀铺于24孔板。然后将Transwell小室（孔径3 μm，直径12 mm）置于24孔板中，使小室的底部能够接触到黑素细胞培养基。胰酶消化HaCaT细胞，亦用DMEM培养基稀释HaCaT浓度至1.5×105个/mL，转入Transwell小室孔中，每孔1 mL，共培养48 h后，分组给药。分别设定空白对照组、阳性药甲氧沙林（8-MOP）组、70%GL组、90%GL组。其中，空白组加入不含血清的DMEM培养基，其余各组均加入无血清药液，配制浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10 μg/mL。各给药组作用24 h后，于显微镜下观察细胞形态并拍照。
2.2 A375细胞增殖检测
细胞接种于24孔培养板培养48 h，经上述方法处理后加入MTT，继续培养4 h，吸弃培养液，加入DMSO震荡溶解后，于酶标仪测定490 nm处吸光度值。
2.3 A375细胞黑素含量检测
A375-HaCaT细胞共培养48 h后，经药物作用后，移去Transwell小室，并吸弃培养基，用PBS洗涤2次。每孔加入1 mol/L的NaOH 500 μL，37 ℃培养箱放置48 h，于酶标仪405 nm测定吸光度值，黑素含量以给药组A405/正常对照组A405×100%表示。
2.4 A375细胞酪氨酸酶激活率检测
药物作用共培养细胞24 h后，弃去培养液，用PBS洗涤2次，每孔加入1%Triton X-100溶液100 μL，迅速置于-80 ℃冰箱 30 min，随后室温融化使细胞完全裂解。然后加入0.25% L-Dopa溶液10 μL/孔，37 ℃培养箱放置2 h，于酶标仪490 nm测定吸光度值。酪氨酸酶激活率以给药组A490/正常对照组A490×100%表示。
2.5 HaCaT细胞干细胞生长因子和内皮素-1检测
A375-HaCaT共培养细胞经药物作用24 h后，从Transwell小室收集细胞上清液，用于测定ET-1和SCF含量。在96孔酶标板的2～11孔中依次加入不同浓度的标准品溶液50 μL，每个浓度重复2孔。在第1孔加入50 μL样品稀释液，其余从12～96孔加入40 μL 样品稀释液和10 μL血清，每个血清样品重复3孔。封膜板封板置于37 ℃温育30 min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。然后每孔加入50 μL酶标试剂，第1孔除外（空白孔）。37 ℃温育30 min、洗涤液洗涤5次，拍干。每孔加入50 μL显色剂A和50 μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应15 min。以第1孔作为空白调零孔，450 nm测定吸光度值。 3 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。数据用—x±s表示，采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 A375-HaCaT细胞共培养体系
HaCaT细胞正常贴壁培养后呈现多角形、团块状。A375细胞呈梭形、双极、三极或多分支树突状。A375︰HaCaT以1︰3的比例通过Transwell小室共培48 h后，A375细胞生长布满24孔板，且细胞形态无明显变化。见图1。
4.2 不同纯度高良姜素对共培养A375细胞增殖影响
与0 ?g/mL浓度组比较，A375-HaCaT共培养体系经不同浓度8-MOP、90%GL、70%GL作用后，其A375细胞增殖均表现为上升，且增殖程度呈现浓度依赖性。但在相同浓度作用下，70%GL较90%GL对A375细胞的促增殖率高。见表1。
4.3 不同纯度高良姜素对共培养A375细胞黑素及酪氨酸酶的影响
与0 ?g/mL浓度组比较，经0.1、0.5、1.0、5.0、10 μg/mL纯度为70%GL和90%GL作用24 h后，A375细胞的黑素含量及酪氨酸酶活性均有增强。当药物浓度≥0.5 μg/mL时，70%GL对A375细胞黑素含量的上调程度明显高于90% GL。而在相同浓度作用下，70% GL也较之90% GL对A375细胞酪氨酸酶激活率高，此外，纯度为70% GL在0.5 μg/mL时对A375细胞酪氨酸酶活性的上调作用最强。见表2。
4.4 不同纯度高良姜素对共培养HaCaT细胞干细胞生长因子、内皮素-1的影响
当药物浓度≥0.5 μg/mL时，纯度为70%和90%的GL对A375细胞的ET-1细胞因子表达具有显著上调作用，但在相同浓度作用下，70%GL较90%GL的上调作用稍强。此外，纯度90%的GL对A375细胞中SCF细胞因子的水平影响不显著，而70%GL在浓度≥0.5 μg/mL时，其对A375细胞SCF细胞因子的上调作用较显著。见表3。
5 讨论
GL是高良姜的有效药用成分，其对单独培养的A375细胞增殖、黑素合成及酪氨酸酶活性的促进作用已得到证实[4]。而本实验中用A375细胞与HaCaT共培养模型，将不同纯度的GL作用于此模型，结果显示，给药浓度从0.1 μg/mL起，纯度70% GL和90% GL均能促进共培养体系中A375细胞增殖，且随着给药浓度增加，其促增殖程度也愈强。此外，纯度为70% GL对A375细胞促增殖强度也明显优于90% GL，提示高良姜治疗白癜风的有效成分并非仅GL这一单独黄酮类成分，可能还有其他黄酮成分发挥作用。
黑素细胞是黑素合成的场所，但大量的研究资料表明，角质形成细胞对黑素细胞增殖及黑素合成具有重要影响[3-4]。黑素细胞位于表皮基底层，每个与其毗邻约36个角质形成细胞在形态和功能上密切关联，构成“表皮黑素单元”。许多学者曾用培养的黑素细胞或黑素瘤细胞来验证对于黑素生成有潜在影响的化合物的作用，但在皮肤和毛发中，黑素细胞与邻近细胞间的相互作用不容忽视，故黑素细胞-角质形成细胞共培养是一种更好的白癜风药物检测模型。目前黑素细胞-角质形成细胞共培养被广泛应用于研究黑素细胞与角质形成细胞的相互作用、色素的转移机制、移植治疗白癜风、筛选和验证药物等方面。近年来研究发现， 角质形成细胞可通过分泌多种细胞因子及与黑素细胞的接触而对黑素细胞的生物学性状产生显著影响。角质形成细胞细胞所表达的碱性成纤维细胞生长因子、SCF、ET、白三烯等均能直接作用于黑素细胞，促进其增殖并合成黑色素[5]。本研究结果表明，0.1、0.5、1.0、5.0、10 μg/mL的GL均能够不同程度地促进A375细胞黑素合成、提高酪氨酸酶活性。此外，其对HaCaT细胞中ET-1和SCF细胞因子的表达具有显著上调作用，这可能是导致GL提高A375细胞酪氨酸酶活性，进而促进黑素合成的内在原因。而在相同药物浓度作用下，70%GL较之90%GL对A375细胞的作用强。这与GL对A375细胞增殖的作用趋势一致，进一步证明高良姜治疗白癜风的有效成分除GL以外还包括其他黄酮类成分。
综上所述，GL能够显著促进A375-HaCaT共培养体系中A375细胞增殖，提高细胞中黑素含量及酪氨酸酶活性。其药物作用机制可能与HaCaT细胞中ET-1和SCF细胞因子的表达升高有关。此外，实验结果表明，在筛选高良姜治疗白癜风的有效成分过程中，GL并非纯度越高药效作用越好。不同纯度GL的药效作用研究为高良姜治疗白癜风的新药研制及临床合理用药奠定了基础。
参考文献：
[1] 胡佳惠，闫明.高良姜的研究进展[J].时珍国医国药，2009，20（10）：2544-2546.
[2] 闫明，霍仕霞，高莉，等.高良姜有效部位在制备治疗白癜风的药物的用途：中国，201010122088.6[P].2011-11-30.
[3] Tomohisa Hirobe. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes[J]. Pigment Cell Res，2004，18：2-12.
[4] 胡晋红，朱全刚.皮肤药理学[M].北京：化学工业出版社，2008：46-50.
[5] 张迪敏，李永伟，许爱娥.黑素细胞与角质形成细胞共培养的应用进展[J].中国美容医学，2005，14（2）：236-238.