【摘 要】
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目的 构建携带SOX9基因的慢病毒载体,转染小鼠脂肪干细胞,观察SOX9基因在脂肪干细胞中的表达.方法 将实验分为3组,体外培养、分化小鼠ADSCs,行免疫荧光鉴定后,使用RT-PCR的方
【机 构】
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武汉华亚美容医院美容外科,湖北医药学院附属人民医院烧伤整形科,武汉大学人民医院整形外科
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目的 构建携带SOX9基因的慢病毒载体,转染小鼠脂肪干细胞,观察SOX9基因在脂肪干细胞中的表达.方法 将实验分为3组,体外培养、分化小鼠ADSCs,行免疫荧光鉴定后,使用RT-PCR的方法获取小鼠SOX9基因编码区片段,将该片段克隆入质粒Pwpxl-MOD2中产Pwpxl-MOD2-SOX9,将四质粒Pwpxl-MOD2-SOX9、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共转染包装细胞293T,获得目的基因SOX9基因的重组病毒(实验组A);同时转染Pwpxl-MOD2,pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G进另一组293T细胞包装产生空载体慢病毒作为阴性对照(实验组B);未转染组为实验组C.收集病毒后,通过基因测序和限制性核酸内切酶酶切的方法对质粒进行鉴定.将包装好的慢病毒Pwpxl-MOD2-SOX9体外转染脂肪干细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染是否成功,并通过流式细胞仪测定转染效率.同时,利用RT-PCR和Western blot检测小鼠SOX9基因的表达.结果 成功分离、培养大鼠的脂肪干细胞;酶切、PCR及测序鉴定证实,慢病毒载体质粒Pwpxl-MOD中插人片段为基因SOX9,包装产生的病毒能较为高效转染小鼠脂肪干细胞.RT-PCR和Western blot检测显示,经SOX9基因转染的小鼠脂肪干细胞表达目的基因产物.结论 成功构建SOX9基因的慢病毒载体并感染脂肪干细胞后能够稳定表达SOX9,这为慢病毒及SOX9基因在软骨组织工程学中的进一步研究奠定了基础.
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