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摘要 在离子色谱法测定信阳毛尖中17种游离氨基酸种类和含量时，选用AminoPac PA-10（2 mm×250 mm）作分析柱，AminoPac PA-10（2 mm×50 mm）作保护柱。采用250 mmol/L氢氧化钠溶液及1 mol/L醋酸钠的混合溶液作流动相，以梯度淋洗的方式实现了茶叶中的17种游离氨基酸在75 min内同时分离和检测。结果表明，本方法测定17种氨基酸保留时间的相对标准偏差在0.04%和0.39%之间，回收率在70.52%～124.08%之间，说明该方法准确可行。
关键词 离子色谱；信阳毛尖；氨基酸
中图分类号 TS272.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）17-0253-03
Abstract In the rapid ion-chromatographic determination of 17 kinds of amino acids composition and content in Xinyang Maojian Tea，using AminoPac PA-10（2 mm×250 mm） as analytical column and AminoPac PA-10（2 mm×50 mm） as protective column which made the 17 kinds of amino acids separated satisfactorily within 75min. A mixed solution of 250 mmol/L NaOH and 1 mol/L NaAc was used as mobile phase. The results showed that relative standard deviation of retention time of 17 kinds of amino acids of this method was between 0.04% and 0.39%，recovery rate was between 70.52% and 124.08%，which showed this method was accurate and feasible.
Key words ion chromatography；Xinyang Maojian Tea；amino acid
目前，茶叶中发现并已得到鉴定的氨基酸共有26种，除了构成蛋白质的20种氨基酸外，还包括6种非蛋白质氨基酸[1]。它们是构成茶叶滋味的重要组成成分，直接影响茶叶的品质。因此，茶叶中氨基酸的定性和定量分析具有重要的意义。
氨基酸的测定由早期的纸色谱法[2]、薄层色谱法[3]等基础分析方法，逐渐发展到氨基酸自动分析仪法[4]、高效液相色谱法[5]和毛细管电泳法[6-7]等仪器分析方法[8]。以高效液相色谱法为代表的检测方法，尤其是各种柱前和柱后衍生方法的发展大大改进了氨基酸检测的选择性和灵敏度。但是这些试验方法具有操作较为繁琐、氨基酸衍生物性质不稳定、衍生反应的副产物和试剂本身会对检测结果产生干扰以及衍生试剂昂贵等限制性因素。离子色谱-积分脉冲安培检测法是一种新的氨基酸分析方法，于1989年由Welch等首先提出，并用金电极实现了对氨基酸的检测[9]。该方法最大的优点是不需要对样品进行衍生，只需将样品稀释到一定浓度后即可直接进样分析，避免了衍生一级胺和二级胺衍生化产物的不同以及衍生化产物不稳定等带来的问题。本试验使用离子色谱-积分脉冲安培检测法对信阳毛尖茶叶中的17种氨基酸进行定性和定量的分析，取得了较为理想的试验结果。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
17种氨基酸标准样品（美国Sigma公司），50%氢氧化钠溶液（赛默飞）、醋酸钠（赛默飞）、盐酸。所有试剂均为分析纯。信阳毛尖茶样购买于本地茶叶市场。
AminoPac PA-10（2 mm×250 mm）氨基酸分析柱；AminoPac PA-10（2 mm×50 mm）氨基酸保护柱；0.22 μmol/L一次性滤头；固相萃取小柱：SPE SCX 4 mL 200 mg强阳离子交换固相萃取小柱。
1.2 主要仪器
ICS-5000离子色谱仪（美国Dionex公司）；EL204型分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Milli-Q超纯水设备（美国Millipore公司）；超声波清洗仪（常州国华）；0.45 μm水相滤膜抽滤系统（津腾）；HZQ-F160型恒温震荡器（太仓实验设备厂）；RE-52AA型旋转蒸发仪。
1.3 试剂配制
250 mmol/L氢氧化钠溶液：称取50.0 g氢氧化钠（纯度大于99.9%）加入盛有50 mL水的聚四氟乙烯烧杯中，溶解冷却后，得到质量分数为50%氢氧化钠溶液，移取13.1 mL氢氧化钠上层清液于1 000 mL容量瓶中，再用水定容至刻度。
1.0 mol/L醋酸钠溶液：称取82.0 g醋酸钠（纯度大于99.9%）于100 mL烧杯中，溶解冷却后转移至1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
0.1 mol/L盐酸溶液：移取8.4 mL浓盐酸（质量分数为37%）于100 mL烧杯中，溶解冷却后转移至1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
0.01 mol/L盐酸溶液：移取10 mL 0.1 mol/L盐酸溶液萃取溶液于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
3 mol/L氨溶液：移取200 mL浓氨水（质量分数为28%）于500 mL烧杯中，溶解冷却后转移至1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
1.4 离子色谱条件 色谱柱：氨基酸阴离子交换柱，固定相为聚二乙烯基苯，官能团为功能性季铵盐；包括分析柱（250 mm×2 mm）和保护柱（50 mm×2 mm）。柱温30 ℃；流速0.25 mL/min；进样量25 μL；流动相A为水，流动相B为250 mmol/L氢氧化钠溶液，流动相C为1 mol/L醋酸钠溶液。梯度洗脱程序如表1所示；检测器为电化学检测器，积分安培检测电化学波形如表2所示。
1.5 茶叶样品制备
称取约1.0 g茶叶，精确至0.1 mg，置于100 mL磨口锥形瓶中，准确加入40 mL 0.1 mol/L盐酸萃取溶液，具塞后置于振荡器振荡30 min，将萃取液经快速滤纸过滤。准确移取滤液1 mL至已经预先依次用3 mL甲醇、3 mL超纯水活化的SCX固相萃取小柱中，然后用0.5 mL 0.01 mol/L盐酸溶液淋洗固相萃取小柱，最后用3 mL 3 mol/L氨溶液洗脱。将洗脱液在65 ℃水浴下旋干，准确加入1 mL 0.1 mol/L盐酸萃取溶液溶解，过滤膜后得到待测样品溶液[10-12]。
1.6 标准溶液配制和工作曲线配制
标准母液配制：取氨基酸标准样品100 μL，加入至400 μL浓度为0.1 mol/L盐酸溶液中。得到含有17种水解氨基酸的标准母液，除甘氨酸浓度为0.25 mmol/L外，其余氨基酸浓度均为0.5 mmol/L。
工作曲线配制：取标准母液分别用0.1 mol/L盐酸溶液稀释2、4、8、10、20倍，得到氨基酸浓度为25.0、50.0、62.5、125.0、250.0 μmol/L的一系列工作溶液（其中，甘氨酸浓度为12.50、25.00、31.25、62.50、125.00 μmol/L）。
2 结果与分析
2.1 线性范围
通过离子色谱对氨基酸混合标样的一系列工作溶液分别进样分析，使用Chromeleon 6.8色谱工作站对各色谱峰进行积分，获得各峰的峰面积，以峰面积对氨基酸浓度作图。17种氨基酸标准曲线方程和相关系数见表3。这17种氨基酸在10～300 μmol/L的浓度范围内均有良好的线性关系，相关系数均在0.99以上[13-15]。
2.2 样品加标回收率
取茶汤样品2份，向其中一份中加入相当于浓度为100 μmol/L氨基酸混标准液，依次进样分析，得到各氨基酸加标回收率在70.52%～124.08%之间。
2.3 重复性和精密度
对5种不同浓度的氨基酸标样依次进样分析，17种氨基酸的保留时间的相对标准偏差在0.04%和0.39%之间，表明该方法的重复性较高（图1、表4）。
取50 μmol/L氨基酸标样连续5次进样分析，17种氨基酸的峰面积和保留时间相对标准偏差分别在0.16%～1.77%和0.07%～0.29%之间。表明该方法的精密度高，相关数据见表4。
2.4 茶叶样品测定
选定的色谱条件下，取已经制备好的茶叶样品溶液25 μL进样3次，测定峰面积值，取平均值。按外标法定量。样品含量测定结果见表5。样品色谱图见图2。
3 结论
建立了离子色谱法测定信阳毛尖中17种的氨基酸种类和含量的方法，解决了传统氨基酸检测方法中的干扰问题，使氨基酸的定性和定量检测更加准确。本方法简单、高效，不仅适用于茶叶中氨基酸的鉴别和检测，同时也可以适用于谷物类、豆类、蔬菜类中的氨基酸的定性和定量分析。
4 参考文献
[1] 宛晓春.茶叶生物化学[M].北京：中国农业出版社，2003：32-33.
[2] SASAOKA K，KILO M.Studies on the biosynthesis of theaninein tea seedlings synthesis of theanine by the homogenate of tea seedlings[J].Agric Biol Chem，1963，27（6）：467-468.
[3] SASAOKA K，KILO M，ONISHI Y. Some properties of the theanine synthesizing enzyme in tea seedlings[J].Agric Biol Chem，1965，29（11）：984-988.
[4] ROACH M C，HARMONY M D.Determination of amino acids at subfem-tomole levels by high·performance liquid chromatography with laser-induced fluorescence detection[J].Anal Chem，1987，59（3）：411-415.
[5] 朱旗，施兆鹏，童京汉，等.HPLC检测分析速溶绿茶游离氨基酸[J].茶叶科学，2001，21（2）：134-136.
[6] 李平，宛晓春，李健，等.茶氨酸的衍生化及毛细管电泳定量技术[J].茶叶科学，2004，24（2）：119-123.
[7] 张峻萍，方从兵，宛晓春，等.茶叶中茶氨酸的胶束电动毛细管电泳定量方法初步研究[J].茶叶通报，2006，28（3）：108-110.
[8] 倪君，须海荣.茶叶氨基酸检测方法的研究进展[J].茶叶，2007，33（2）：63-66.
[9] 朱岩，王素芬.离子色谱间接抑制电导检测氨基酸类物质[J].分析科学学报，2000，16（2）：176-178.
[10] 诸葛庆，李博斌，刘兴泉，等.用离子色谱法分析研究黄酒中的氨基酸[J].酿酒科技，2008（4）：108-111.
[11] 王洋，黄雪松.离子色谱法测定荔枝核及其732树脂洗脱液的游离氨基酸[J].食品研究与开发，2008（6）：106-110.
[12] 周政华，杨元，洪君蓉，等.固相萃取-离子色谱-积分脉冲安培法测定人血清中游离氨基酸[J].分析化学，2007（7）：1063-1066.
[13] 李辉，岳先领，李皓，等.离子色谱法测定烟叶中游离氨基酸[J].湖北农业科学，2015（23）：6023-6025.
[14]于宏晓，徐海涛，马强，等.离子色谱-积分脉冲安培法测定烟草中18种游离氨基酸[J].中国烟草科学，2012（4）：51-54.
[15] 李路华，周建科，岳强，等.离子色谱间接电导法测定酱油及醋中的氨基酸[J].中国调味品，2005（1）：49-51.
关键词 离子色谱；信阳毛尖；氨基酸
中图分类号 TS272.7 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）17-0253-03
Abstract In the rapid ion-chromatographic determination of 17 kinds of amino acids composition and content in Xinyang Maojian Tea，using AminoPac PA-10（2 mm×250 mm） as analytical column and AminoPac PA-10（2 mm×50 mm） as protective column which made the 17 kinds of amino acids separated satisfactorily within 75min. A mixed solution of 250 mmol/L NaOH and 1 mol/L NaAc was used as mobile phase. The results showed that relative standard deviation of retention time of 17 kinds of amino acids of this method was between 0.04% and 0.39%，recovery rate was between 70.52% and 124.08%，which showed this method was accurate and feasible.
Key words ion chromatography；Xinyang Maojian Tea；amino acid
目前，茶叶中发现并已得到鉴定的氨基酸共有26种，除了构成蛋白质的20种氨基酸外，还包括6种非蛋白质氨基酸[1]。它们是构成茶叶滋味的重要组成成分，直接影响茶叶的品质。因此，茶叶中氨基酸的定性和定量分析具有重要的意义。
氨基酸的测定由早期的纸色谱法[2]、薄层色谱法[3]等基础分析方法，逐渐发展到氨基酸自动分析仪法[4]、高效液相色谱法[5]和毛细管电泳法[6-7]等仪器分析方法[8]。以高效液相色谱法为代表的检测方法，尤其是各种柱前和柱后衍生方法的发展大大改进了氨基酸检测的选择性和灵敏度。但是这些试验方法具有操作较为繁琐、氨基酸衍生物性质不稳定、衍生反应的副产物和试剂本身会对检测结果产生干扰以及衍生试剂昂贵等限制性因素。离子色谱-积分脉冲安培检测法是一种新的氨基酸分析方法，于1989年由Welch等首先提出，并用金电极实现了对氨基酸的检测[9]。该方法最大的优点是不需要对样品进行衍生，只需将样品稀释到一定浓度后即可直接进样分析，避免了衍生一级胺和二级胺衍生化产物的不同以及衍生化产物不稳定等带来的问题。本试验使用离子色谱-积分脉冲安培检测法对信阳毛尖茶叶中的17种氨基酸进行定性和定量的分析，取得了较为理想的试验结果。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
17种氨基酸标准样品（美国Sigma公司），50%氢氧化钠溶液（赛默飞）、醋酸钠（赛默飞）、盐酸。所有试剂均为分析纯。信阳毛尖茶样购买于本地茶叶市场。
AminoPac PA-10（2 mm×250 mm）氨基酸分析柱；AminoPac PA-10（2 mm×50 mm）氨基酸保护柱；0.22 μmol/L一次性滤头；固相萃取小柱：SPE SCX 4 mL 200 mg强阳离子交换固相萃取小柱。
1.2 主要仪器
ICS-5000离子色谱仪（美国Dionex公司）；EL204型分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；Milli-Q超纯水设备（美国Millipore公司）；超声波清洗仪（常州国华）；0.45 μm水相滤膜抽滤系统（津腾）；HZQ-F160型恒温震荡器（太仓实验设备厂）；RE-52AA型旋转蒸发仪。
1.3 试剂配制
250 mmol/L氢氧化钠溶液：称取50.0 g氢氧化钠（纯度大于99.9%）加入盛有50 mL水的聚四氟乙烯烧杯中，溶解冷却后，得到质量分数为50%氢氧化钠溶液，移取13.1 mL氢氧化钠上层清液于1 000 mL容量瓶中，再用水定容至刻度。
1.0 mol/L醋酸钠溶液：称取82.0 g醋酸钠（纯度大于99.9%）于100 mL烧杯中，溶解冷却后转移至1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
0.1 mol/L盐酸溶液：移取8.4 mL浓盐酸（质量分数为37%）于100 mL烧杯中，溶解冷却后转移至1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
0.01 mol/L盐酸溶液：移取10 mL 0.1 mol/L盐酸溶液萃取溶液于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
3 mol/L氨溶液：移取200 mL浓氨水（质量分数为28%）于500 mL烧杯中，溶解冷却后转移至1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
1.4 离子色谱条件 色谱柱：氨基酸阴离子交换柱，固定相为聚二乙烯基苯，官能团为功能性季铵盐；包括分析柱（250 mm×2 mm）和保护柱（50 mm×2 mm）。柱温30 ℃；流速0.25 mL/min；进样量25 μL；流动相A为水，流动相B为250 mmol/L氢氧化钠溶液，流动相C为1 mol/L醋酸钠溶液。梯度洗脱程序如表1所示；检测器为电化学检测器，积分安培检测电化学波形如表2所示。
1.5 茶叶样品制备
称取约1.0 g茶叶，精确至0.1 mg，置于100 mL磨口锥形瓶中，准确加入40 mL 0.1 mol/L盐酸萃取溶液，具塞后置于振荡器振荡30 min，将萃取液经快速滤纸过滤。准确移取滤液1 mL至已经预先依次用3 mL甲醇、3 mL超纯水活化的SCX固相萃取小柱中，然后用0.5 mL 0.01 mol/L盐酸溶液淋洗固相萃取小柱，最后用3 mL 3 mol/L氨溶液洗脱。将洗脱液在65 ℃水浴下旋干，准确加入1 mL 0.1 mol/L盐酸萃取溶液溶解，过滤膜后得到待测样品溶液[10-12]。
1.6 标准溶液配制和工作曲线配制
标准母液配制：取氨基酸标准样品100 μL，加入至400 μL浓度为0.1 mol/L盐酸溶液中。得到含有17种水解氨基酸的标准母液，除甘氨酸浓度为0.25 mmol/L外，其余氨基酸浓度均为0.5 mmol/L。
工作曲线配制：取标准母液分别用0.1 mol/L盐酸溶液稀释2、4、8、10、20倍，得到氨基酸浓度为25.0、50.0、62.5、125.0、250.0 μmol/L的一系列工作溶液（其中，甘氨酸浓度为12.50、25.00、31.25、62.50、125.00 μmol/L）。
2 结果与分析
2.1 线性范围
通过离子色谱对氨基酸混合标样的一系列工作溶液分别进样分析，使用Chromeleon 6.8色谱工作站对各色谱峰进行积分，获得各峰的峰面积，以峰面积对氨基酸浓度作图。17种氨基酸标准曲线方程和相关系数见表3。这17种氨基酸在10～300 μmol/L的浓度范围内均有良好的线性关系，相关系数均在0.99以上[13-15]。
2.2 样品加标回收率
取茶汤样品2份，向其中一份中加入相当于浓度为100 μmol/L氨基酸混标准液，依次进样分析，得到各氨基酸加标回收率在70.52%～124.08%之间。
2.3 重复性和精密度
对5种不同浓度的氨基酸标样依次进样分析，17种氨基酸的保留时间的相对标准偏差在0.04%和0.39%之间，表明该方法的重复性较高（图1、表4）。
取50 μmol/L氨基酸标样连续5次进样分析，17种氨基酸的峰面积和保留时间相对标准偏差分别在0.16%～1.77%和0.07%～0.29%之间。表明该方法的精密度高，相关数据见表4。
2.4 茶叶样品测定
选定的色谱条件下，取已经制备好的茶叶样品溶液25 μL进样3次，测定峰面积值，取平均值。按外标法定量。样品含量测定结果见表5。样品色谱图见图2。
3 结论
建立了离子色谱法测定信阳毛尖中17种的氨基酸种类和含量的方法，解决了传统氨基酸检测方法中的干扰问题，使氨基酸的定性和定量检测更加准确。本方法简单、高效，不仅适用于茶叶中氨基酸的鉴别和检测，同时也可以适用于谷物类、豆类、蔬菜类中的氨基酸的定性和定量分析。
4 参考文献
[1] 宛晓春.茶叶生物化学[M].北京：中国农业出版社，2003：32-33.
[2] SASAOKA K，KILO M.Studies on the biosynthesis of theaninein tea seedlings synthesis of theanine by the homogenate of tea seedlings[J].Agric Biol Chem，1963，27（6）：467-468.
[3] SASAOKA K，KILO M，ONISHI Y. Some properties of the theanine synthesizing enzyme in tea seedlings[J].Agric Biol Chem，1965，29（11）：984-988.
[4] ROACH M C，HARMONY M D.Determination of amino acids at subfem-tomole levels by high·performance liquid chromatography with laser-induced fluorescence detection[J].Anal Chem，1987，59（3）：411-415.
[5] 朱旗，施兆鹏，童京汉，等.HPLC检测分析速溶绿茶游离氨基酸[J].茶叶科学，2001，21（2）：134-136.
[6] 李平，宛晓春，李健，等.茶氨酸的衍生化及毛细管电泳定量技术[J].茶叶科学，2004，24（2）：119-123.
[7] 张峻萍，方从兵，宛晓春，等.茶叶中茶氨酸的胶束电动毛细管电泳定量方法初步研究[J].茶叶通报，2006，28（3）：108-110.
[8] 倪君，须海荣.茶叶氨基酸检测方法的研究进展[J].茶叶，2007，33（2）：63-66.
[9] 朱岩，王素芬.离子色谱间接抑制电导检测氨基酸类物质[J].分析科学学报，2000，16（2）：176-178.
[10] 诸葛庆，李博斌，刘兴泉，等.用离子色谱法分析研究黄酒中的氨基酸[J].酿酒科技，2008（4）：108-111.
[11] 王洋，黄雪松.离子色谱法测定荔枝核及其732树脂洗脱液的游离氨基酸[J].食品研究与开发，2008（6）：106-110.
[12] 周政华，杨元，洪君蓉，等.固相萃取-离子色谱-积分脉冲安培法测定人血清中游离氨基酸[J].分析化学，2007（7）：1063-1066.
[13] 李辉，岳先领，李皓，等.离子色谱法测定烟叶中游离氨基酸[J].湖北农业科学，2015（23）：6023-6025.
[14]于宏晓，徐海涛，马强，等.离子色谱-积分脉冲安培法测定烟草中18种游离氨基酸[J].中国烟草科学，2012（4）：51-54.
[15] 李路华，周建科，岳强，等.离子色谱间接电导法测定酱油及醋中的氨基酸[J].中国调味品，2005（1）：49-51.