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【摘 要】目的：分析溃疡性结肠炎患者外周血中T细胞亚群数量和比例的变化，观察综合护理模式对其疗效的作用。方法：选择20例UC患者，分离外周血单核细胞（PBMC），采用流式细胞术（FCM）检测Th1、Th2、Th17细胞的数量及Th1/Th2比值，ELISA法测检UC患者综合护护理前后PBMC培养上清中IFN-γ、IL-17、IL-4细胞因子水平，用采用综合护理模式观察其效果， 与同期选择的健康对照组比较分析。结果：UC患者综合护理前PBMC中IFN-γ+Th1、IL-17+Th17细胞的数量，Th1/Th2比值均高于健康对照组，差别有统计学意义；综合护理处理后，Th1、Th17细胞的数量及Th1/Th2比值的与对照组比较，差别均无统计学意义。综合护理处理前IFN-γ、IL-17水平高于健康对照组，差异均有统计学意义；综合护理处理后， 细胞因子的差异均无统计学意义。结论：UC患者外周血免疫紊乱在其发病机制中发挥重要作用，采用综合护理模式可改善其免疫紊乱状态，有利于患者恢复健康。
【关键词】溃疡性结肠炎；免疫紊乱；综合护理
【中图分类号】R574 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）11-0780-02
溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种病因未明的免疫性疾病。近年来研究表明UC患者T细胞免疫失衡与其发病机制密切相关 [1-2]，但其临床治疗效果不佳，常常影响患者的生活质量。本研究将检测患者外周血的T细胞亚群的表达和相应的细胞因子水平， 并运用综合护理模式处理UC患者，为UC患者的临床康复寻找新的具有临床意义的方法。
1 材料和方法
1.1 临床资料 20例溃疡性结肠炎患者取自本院总部，男12例，女8例，年龄21～64岁，中位年龄35岁，均符合UC诊断标准[3]，20例UC病例组，采用综合护理措施处理10个月以上；正常对照20例取自本院体检部，为健康人群，排除UC及其它自身免疫性疾病，其中男11例，女9例，年龄25～61岁，中位年龄33岁。
1.2 检测仪器与试剂 小鼠抗人CD4单克隆抗体IgG1、FITC-抗人IFN-γIgG1/PE-抗人IL-4及同型对照、流式细胞仪均购自美国BD公司。FITC-抗人IL-17及同型对照IgG1购自美国Ebioscience公司。佛波酯（PMA）、离子霉素、莫能菌素购自美国Sigma公司， RPMI1640培养液购自美国Gibco公司。抗人IL-4 ELISA试剂盒、 抗人IFN-γ ELISA试剂盒购于美国R&D公司。抗人IL-17 ELISA试剂盒购于美国Ebioscience公司。
1.3 方法
1.3.1 淋巴细胞分离与 Th细胞亚群测定 分别抽取UC患者组、综合护理处理组和健康对照组外周静脉血5 mL， 采用肝素钠抗凝， Ficol1密度梯度离心法分离PBMC， 调整PBMC密度为1×109/L， 懸浮于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中，同步取1 mL细胞悬液， 进行细胞内细胞因子染色，FCM测定Th细胞亚群；取2 mL细胞悬液加入PMA（50 μg/L）、离子霉素（1 μmol/L）置于37℃孵箱中培养过夜， 收集上清置于-70℃冻存待ELISA检测。 取上述PBMC悬液（1×109/L）置于48孔培养板内， 每孔1 mL， 并加PMA （50 μg/L）、离子霉素（1 μmol/L）和蛋白转运抑制剂莫能菌素（2 μmol/L）以阻止细胞因子向细胞外分泌， 在37℃孵箱中培养5 h。收集细胞分为对照管和实验管， 分别加入PercP小鼠抗人CD4 mAb IgG1 10 μL， 混匀， 室温放置20 min对细胞表面抗原进行染色。加入Cytofix/Cytoperm液200 μL，4℃放置20 min， 通透和固定细胞并洗涤后， 进行胞内细胞因子染色， 实验管分别加入IFN-γ mAb IgG1/PE，抗人IL-4 /FITC， FITC抗人IL-17 mAb IgG1各10 uL， 对照管加入同型对照抗体， 4℃避光孵育30 min后， 用Perm/Wash液1 mL洗涤2次， 最后以300 μL洗涤液重悬细胞，24 h内采用FCM检测分析。以CD4直方图设门区分Th细胞（CD4+）， 最终以散点图IFN-γ、 IL-4和IL-17染色阳性表示Th1细胞、 Th2细胞和Th17细胞， 用Cellsquest软件获取并分析数据。
1.3.3 外周血单核细胞培养上清中IFN-γ、 IL-4、 IL-17的检测 取上述冻存PBMC培养上清， 采用ELISA法检测上清中IFN-γ、IL-4、IL-17水平， 具体操作按试剂盒提供的说明书进行，每个样本和标准品均设3个复孔， 酶标测试仪450 nm处读数。
1.3.4 综合护理措施处理病人至少10个月 （1）休息：给病人提供安静、舒适的休息环境，注意劳逸结合，生活要有规律，保持心情舒畅，以减少病人的胃肠蠕动及体力消耗；（2）严密观察病情：注意监测病人的体温、脉搏、心率、血压的变化，同时观察病人的皮肤弹性、有无脱水表现。还应注意观察腹泻、腹部压痛及肠鸣音情况，如出现鼓肠、肠鸣音消失，腹痛加剧等情况，要考虑中毒性巨结肠的发生，积极采取抢救措施；（3）饮食护理：应给予高热量、富营养而少纤维、易消化、软食物，禁食生、冷食物及含纤维素多的蔬菜、水果，忌食牛乳和乳制品。急性发作期病人应进食无渣流质或半流质饮食，病情严重者应禁食，并给以胃肠外营养，使肠道得以休息，利于减轻炎症，控制其症状；（4）腹泻护理：由于病人腹泻次数较多，协助病人作好肛门及周围皮肤的护理，如手纸要柔软，擦拭动作宜轻柔，便后用肥皂与温水清洗肛门及周围皮肤，清洗后轻轻拭干，必要时给予护肤软膏涂擦，以防皮肤破损。同时注意观察粪便的量、性状，排便次数；（5）心理护理与中医调理：由于本病的病程特点，病人易出现抑郁和焦虑。为此应耐心向病人做好卫生宣教工作，使其积极配合治疗。同时帮助病人认识到不良心理状态不利于本病的修复，从而建立起战胜疾病的信心和勇气。 1.3.5 统计学处理 实验结果用 表示，采用SPSS14.0软件分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 UC患者综合护理处理前后外周血Th1/Th2、Th17细胞亚群的变化 细胞膜表面标志和胞内细胞因子染色流式细胞仪测定结果显示， UC患者综合护理处理前，外周血中CD4+IFN-γ+Th1细胞、Th1/Th2细胞比值、CD4+IL-17+Th17细胞的数量均高于健康对照组，差别有统计学意义；综合护理处理后，外周血中CD4+IFN-γ+Th1细胞、Th1/Th2细胞比值、CD4+IL-17+Th17细胞的数量与健康对照组比较，均无显著性差异，见表1。
3 讨论
综合护理是现代医学临床护理的重要方式，特别是在一些慢性病患者中可能发挥重要作用，综合使用可能改善机体的免疫状态。溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种常见的慢性免疫性疾病，目前还难以找到特异而有效的治疗方法。研究发现，Th17细胞是一种新型的CD4+效应T细胞，它与传统的Th细胞相比，是一群不同的T细胞亚型，在自身免疫病的发病机制中发挥重要的免疫调节作用[3，4]，它可能加重自身免疫的病情。近年来研究表明UC患者Th细胞免疫失衡与其发病机制密切相关，但其具体机制尚未完全明确[5]。既往研究发现UC发生发展与Th1、Th2细胞数量和比例失衡密切相关， 而近年发现，有一种特殊产生细胞因子IL-17的辅助型T细胞，在炎症疾病与自身免疫性疾病中发挥重要作用，该细胞不同于传统的Th1、Th2细胞，是一种新型的辅助性T细胞，定义为Th17细胞。动物模型证实IL-17促进炎性细胞因子IL-6、 TNF-α的合成并参与炎症反应， 提出以分泌IL-17为主的Th17细胞在一些炎性疾病的发病中具有比Th1/Th2更重要的作用[6，7]。我们检测UC患者Th1、Th2及Th17细胞亚群数量和比例， 发现综合护理处理前，它们的比值均高于健康对照组，但是经过较长时间的综合护理后，患者的免疫状态有较大的改善， 有利于患者的康复，为临床治疗提供新的理论依据。
在综合护理处理前，我们通过FCM检测外周血中Th细胞数量和比例的变化， 发现UC患者Th1、Th17细胞数量均高于健康对照组， 而Th2细胞无明显差异， 导致Th1/Th2相对比例升高。同时通过ELISA分析体外培养PBMC上清中相应细胞因子的水平， 证明IFN-γ、 IL-17水平也高于健康对照组。研究结果提示， 在UC患者外周血中， Th1与Th17细胞亚群处于主导地位，但是在综合护理处理几周后，患者的免疫相关的细胞因子慢慢恢复平衡，患者的生活状也也相应改善，有利于UC患者的治疗，但具体机制与方法有待进一步探索[8，10]。
综上所述， 我们的研究表明UC患者Th相关细胞及其因子的失衡可能在UC的发病机制中起到较大作用，可通过综合护理的方式调节Th细胞的平衡来控制溃疡性结肠炎患者机体的免疫状态，提高患者的生活质量。
参考文献：
[1] Dong Z， Du L， Xu X， et al. Aberrant expression of circulating Th17， Th1 and Tc1 cells in patients with active and inactive ulcerative colitis. Int J Mol Med. 2013 Apr；31（4）：989-97.
[2] Narender Nath， Ratna Prasad， Shailendra Giri，et al. T-bet is essential for the progression of experimental autoimmune encephalomyelitis .Immunology， 2006， 118 （3） ：384-391 .
[3] 楊丽， 刘占举. Th17细胞在炎症性肠病发生过程中的免疫病理作用[J]. 世界华人消化杂志， 2009， （4） ：389-394.
[4] O'Connor M， Bager P， Duncan J， et al. N-ECCO Consensus statements on the European nursing roles in caring for patients with Crohn's disease or ulcerative colitis. J Crohns Colitis. 2013 ；7（9）：744-64.
[5] Nurmi E， Haapam?ki J， Paavilainen E， et al. The burden of inflammatory bowel disease on health care utilization and quality of life. Scand J Gastroenterol. 2013 ；48（1）：51-7.
[6] 中华医学会消化病学分会. 对炎症性肠病诊断治疗规范的建议. 中华消化杂志 2001； 21： 236-239.
[7] Singh K， Coburn LA， Barry DP， et al. Deletion of cationic amino acid transporter 2 exacerbates dextran sulfate sodium colitis and leads to an IL-17-predominant T cell response. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2013 ；305（3）：G225-40.
[8] 李军华， 周薇. 溃疡性结肠炎患者血清趋化因子的变化及其意义[J]. 现代预防医学， 2009， （04） ：719-721.
[9] 郑连鹏， 吕宗舜， 张洁， 等. 中国大陆地区炎症性肠病肠外表现的汇总分析[J]. 世界华人消化杂志， 2009， （21） ：2217-2220.
[10] Kekilli M， Tunc B， Beyazit Y， et al. Circulating CD4+CD25+ regulatory T cells in the pathobiology of ulcerative colitis and concurrent primary sclerosing cholangitis. Dig Dis Sci. 2013 ；58（5）：1250-5.
【关键词】溃疡性结肠炎；免疫紊乱；综合护理
【中图分类号】R574 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）11-0780-02
溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种病因未明的免疫性疾病。近年来研究表明UC患者T细胞免疫失衡与其发病机制密切相关 [1-2]，但其临床治疗效果不佳，常常影响患者的生活质量。本研究将检测患者外周血的T细胞亚群的表达和相应的细胞因子水平， 并运用综合护理模式处理UC患者，为UC患者的临床康复寻找新的具有临床意义的方法。
1 材料和方法
1.1 临床资料 20例溃疡性结肠炎患者取自本院总部，男12例，女8例，年龄21～64岁，中位年龄35岁，均符合UC诊断标准[3]，20例UC病例组，采用综合护理措施处理10个月以上；正常对照20例取自本院体检部，为健康人群，排除UC及其它自身免疫性疾病，其中男11例，女9例，年龄25～61岁，中位年龄33岁。
1.2 检测仪器与试剂 小鼠抗人CD4单克隆抗体IgG1、FITC-抗人IFN-γIgG1/PE-抗人IL-4及同型对照、流式细胞仪均购自美国BD公司。FITC-抗人IL-17及同型对照IgG1购自美国Ebioscience公司。佛波酯（PMA）、离子霉素、莫能菌素购自美国Sigma公司， RPMI1640培养液购自美国Gibco公司。抗人IL-4 ELISA试剂盒、 抗人IFN-γ ELISA试剂盒购于美国R&D公司。抗人IL-17 ELISA试剂盒购于美国Ebioscience公司。
1.3 方法
1.3.1 淋巴细胞分离与 Th细胞亚群测定 分别抽取UC患者组、综合护理处理组和健康对照组外周静脉血5 mL， 采用肝素钠抗凝， Ficol1密度梯度离心法分离PBMC， 调整PBMC密度为1×109/L， 懸浮于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中，同步取1 mL细胞悬液， 进行细胞内细胞因子染色，FCM测定Th细胞亚群；取2 mL细胞悬液加入PMA（50 μg/L）、离子霉素（1 μmol/L）置于37℃孵箱中培养过夜， 收集上清置于-70℃冻存待ELISA检测。 取上述PBMC悬液（1×109/L）置于48孔培养板内， 每孔1 mL， 并加PMA （50 μg/L）、离子霉素（1 μmol/L）和蛋白转运抑制剂莫能菌素（2 μmol/L）以阻止细胞因子向细胞外分泌， 在37℃孵箱中培养5 h。收集细胞分为对照管和实验管， 分别加入PercP小鼠抗人CD4 mAb IgG1 10 μL， 混匀， 室温放置20 min对细胞表面抗原进行染色。加入Cytofix/Cytoperm液200 μL，4℃放置20 min， 通透和固定细胞并洗涤后， 进行胞内细胞因子染色， 实验管分别加入IFN-γ mAb IgG1/PE，抗人IL-4 /FITC， FITC抗人IL-17 mAb IgG1各10 uL， 对照管加入同型对照抗体， 4℃避光孵育30 min后， 用Perm/Wash液1 mL洗涤2次， 最后以300 μL洗涤液重悬细胞，24 h内采用FCM检测分析。以CD4直方图设门区分Th细胞（CD4+）， 最终以散点图IFN-γ、 IL-4和IL-17染色阳性表示Th1细胞、 Th2细胞和Th17细胞， 用Cellsquest软件获取并分析数据。
1.3.3 外周血单核细胞培养上清中IFN-γ、 IL-4、 IL-17的检测 取上述冻存PBMC培养上清， 采用ELISA法检测上清中IFN-γ、IL-4、IL-17水平， 具体操作按试剂盒提供的说明书进行，每个样本和标准品均设3个复孔， 酶标测试仪450 nm处读数。
1.3.4 综合护理措施处理病人至少10个月 （1）休息：给病人提供安静、舒适的休息环境，注意劳逸结合，生活要有规律，保持心情舒畅，以减少病人的胃肠蠕动及体力消耗；（2）严密观察病情：注意监测病人的体温、脉搏、心率、血压的变化，同时观察病人的皮肤弹性、有无脱水表现。还应注意观察腹泻、腹部压痛及肠鸣音情况，如出现鼓肠、肠鸣音消失，腹痛加剧等情况，要考虑中毒性巨结肠的发生，积极采取抢救措施；（3）饮食护理：应给予高热量、富营养而少纤维、易消化、软食物，禁食生、冷食物及含纤维素多的蔬菜、水果，忌食牛乳和乳制品。急性发作期病人应进食无渣流质或半流质饮食，病情严重者应禁食，并给以胃肠外营养，使肠道得以休息，利于减轻炎症，控制其症状；（4）腹泻护理：由于病人腹泻次数较多，协助病人作好肛门及周围皮肤的护理，如手纸要柔软，擦拭动作宜轻柔，便后用肥皂与温水清洗肛门及周围皮肤，清洗后轻轻拭干，必要时给予护肤软膏涂擦，以防皮肤破损。同时注意观察粪便的量、性状，排便次数；（5）心理护理与中医调理：由于本病的病程特点，病人易出现抑郁和焦虑。为此应耐心向病人做好卫生宣教工作，使其积极配合治疗。同时帮助病人认识到不良心理状态不利于本病的修复，从而建立起战胜疾病的信心和勇气。 1.3.5 统计学处理 实验结果用 表示，采用SPSS14.0软件分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 UC患者综合护理处理前后外周血Th1/Th2、Th17细胞亚群的变化 细胞膜表面标志和胞内细胞因子染色流式细胞仪测定结果显示， UC患者综合护理处理前，外周血中CD4+IFN-γ+Th1细胞、Th1/Th2细胞比值、CD4+IL-17+Th17细胞的数量均高于健康对照组，差别有统计学意义；综合护理处理后，外周血中CD4+IFN-γ+Th1细胞、Th1/Th2细胞比值、CD4+IL-17+Th17细胞的数量与健康对照组比较，均无显著性差异，见表1。
3 讨论
综合护理是现代医学临床护理的重要方式，特别是在一些慢性病患者中可能发挥重要作用，综合使用可能改善机体的免疫状态。溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种常见的慢性免疫性疾病，目前还难以找到特异而有效的治疗方法。研究发现，Th17细胞是一种新型的CD4+效应T细胞，它与传统的Th细胞相比，是一群不同的T细胞亚型，在自身免疫病的发病机制中发挥重要的免疫调节作用[3，4]，它可能加重自身免疫的病情。近年来研究表明UC患者Th细胞免疫失衡与其发病机制密切相关，但其具体机制尚未完全明确[5]。既往研究发现UC发生发展与Th1、Th2细胞数量和比例失衡密切相关， 而近年发现，有一种特殊产生细胞因子IL-17的辅助型T细胞，在炎症疾病与自身免疫性疾病中发挥重要作用，该细胞不同于传统的Th1、Th2细胞，是一种新型的辅助性T细胞，定义为Th17细胞。动物模型证实IL-17促进炎性细胞因子IL-6、 TNF-α的合成并参与炎症反应， 提出以分泌IL-17为主的Th17细胞在一些炎性疾病的发病中具有比Th1/Th2更重要的作用[6，7]。我们检测UC患者Th1、Th2及Th17细胞亚群数量和比例， 发现综合护理处理前，它们的比值均高于健康对照组，但是经过较长时间的综合护理后，患者的免疫状态有较大的改善， 有利于患者的康复，为临床治疗提供新的理论依据。
在综合护理处理前，我们通过FCM检测外周血中Th细胞数量和比例的变化， 发现UC患者Th1、Th17细胞数量均高于健康对照组， 而Th2细胞无明显差异， 导致Th1/Th2相对比例升高。同时通过ELISA分析体外培养PBMC上清中相应细胞因子的水平， 证明IFN-γ、 IL-17水平也高于健康对照组。研究结果提示， 在UC患者外周血中， Th1与Th17细胞亚群处于主导地位，但是在综合护理处理几周后，患者的免疫相关的细胞因子慢慢恢复平衡，患者的生活状也也相应改善，有利于UC患者的治疗，但具体机制与方法有待进一步探索[8，10]。
综上所述， 我们的研究表明UC患者Th相关细胞及其因子的失衡可能在UC的发病机制中起到较大作用，可通过综合护理的方式调节Th细胞的平衡来控制溃疡性结肠炎患者机体的免疫状态，提高患者的生活质量。
参考文献：
[1] Dong Z， Du L， Xu X， et al. Aberrant expression of circulating Th17， Th1 and Tc1 cells in patients with active and inactive ulcerative colitis. Int J Mol Med. 2013 Apr；31（4）：989-97.
[2] Narender Nath， Ratna Prasad， Shailendra Giri，et al. T-bet is essential for the progression of experimental autoimmune encephalomyelitis .Immunology， 2006， 118 （3） ：384-391 .
[3] 楊丽， 刘占举. Th17细胞在炎症性肠病发生过程中的免疫病理作用[J]. 世界华人消化杂志， 2009， （4） ：389-394.
[4] O'Connor M， Bager P， Duncan J， et al. N-ECCO Consensus statements on the European nursing roles in caring for patients with Crohn's disease or ulcerative colitis. J Crohns Colitis. 2013 ；7（9）：744-64.
[5] Nurmi E， Haapam?ki J， Paavilainen E， et al. The burden of inflammatory bowel disease on health care utilization and quality of life. Scand J Gastroenterol. 2013 ；48（1）：51-7.
[6] 中华医学会消化病学分会. 对炎症性肠病诊断治疗规范的建议. 中华消化杂志 2001； 21： 236-239.
[7] Singh K， Coburn LA， Barry DP， et al. Deletion of cationic amino acid transporter 2 exacerbates dextran sulfate sodium colitis and leads to an IL-17-predominant T cell response. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2013 ；305（3）：G225-40.
[8] 李军华， 周薇. 溃疡性结肠炎患者血清趋化因子的变化及其意义[J]. 现代预防医学， 2009， （04） ：719-721.
[9] 郑连鹏， 吕宗舜， 张洁， 等. 中国大陆地区炎症性肠病肠外表现的汇总分析[J]. 世界华人消化杂志， 2009， （21） ：2217-2220.
[10] Kekilli M， Tunc B， Beyazit Y， et al. Circulating CD4+CD25+ regulatory T cells in the pathobiology of ulcerative colitis and concurrent primary sclerosing cholangitis. Dig Dis Sci. 2013 ；58（5）：1250-5.