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摘 要：目的：探究微小RNA146a（miR146a）與趋化因子受体4（CXCR4）在糖尿病心肌病心肌成纤维细胞（CFs）中的表达变化。方法：提取原代心肌成纤维细胞（Cardiac fibroblasts，CFs），高糖（33.3mmol·L1）作用CFs。用qRTPCR检测CFs中miR146a的表达，Western blotting检测CFs中α平滑肌肌动蛋白（αSMA）、Ⅰ型胶原前胶原A1（Col1A1）、CXCR4蛋白的表达情况。MTT检测高糖对CFs增殖活性的影响。结果：与正常对照组相比，高糖诱导后的CFs中miR146a表达量降低，而高糖诱导后的CFs中αSMA、Col1A1、CXCR4表达增加。并且高糖处理后CFs增殖活性提高。结论：糖尿病心肌病形成过程中CFs中miR146a表达下调，而CXCR4表达上调，提示miR146a与CXCR4糖尿病心肌病的病程中可能存在潜在的调节关系，有助于探索糖尿病心肌病的病理机制。
关键词：miR146a;CXCR4;糖尿病心肌病;心肌纤维化
中图分类号：R 542.23
To investigate the expression changes ofMicroRNA146a and CXCR4
in myocardial tissue and fibroblasts of diabetic cardiomyopathy
Wang Can1，2 Tao Hui1，2 Jiang Shumei1，2 Wang Lichao1，2 Shi Kaihu1，2*
1.Dept of Cardiothoracic Surgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University AnhuiHefei 230601;
2.Cardiovascular Research Center，Anhui Medical University AnhuiHefei 230601
Abstract：Objective：To investigate the expression changes of microRNA146a （miR146a） and chemokine receptor 4 （CXCR4） in diabetic cardiomyopathy myocardial fibroblasts （CFS）.Methods：CFS were extracted and high glucose （33.3mmol·L1） was used to induce CFs.Use qRTPCR in the detection of CFs miR146a express，Western blotting detection in CFs the expression of αSMA，Col1A1，and CXCR4.MTT was used to detect the effect of high glucose on the proliferation of CFS.Results：Compared with the normal control group，the expression of miR146a decreased in CFs induced by high glucose，while the expression of αSMA，Col1A1 and CXCR4 increased in CFs induced by high glucose.The proliferation activity of CFs was increased after high glucose treatment.Conclusion：During the formation of diabetic cardiomyopathy，miR146a expression is downregulated in CFs，while CXCR4 expression is upregulated，suggesting that there may be a potential regulatory relationship between miR146a and CXCR4 in the course of diabetic cardiomyopathy，which is helpful to explore the pathological mechanism of diabetic cardiomyopathy. Keywords：miR146a;CXCR4;Diabetic cardiomyopathy;Myocardial fibrosis
糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy，DCM）是指在没有其他心脏危险因素如冠状动脉疾病、瓣膜病或高血压等疾病的影响下，因糖尿病而损伤心肌造成心脏结构和功能异常[1]。高血糖会诱导心肌成纤维细胞异常增殖和细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的沉积加速心肌纤维化（Myocardial fibrosis，MF）进程，最终导致心功能不全[2]。MicroRNAs是一类内源性非编码小RNA，长度一般在22～23个核苷酸序列[3]，研究表明，有多种miRNAs参与调控糖尿病心肌纤维化的进程[4]。据报道，miR146a参与了肝纤维化的进程[5]。CXCR4是一类趋化因子受体[6]，CXCR4在纤维化方面的作用也多有报道[78]。本研究，通过细胞实验观察miR146a与CXCR4在糖尿病心肌病CFs中的表达变化，探究其在糖尿病心肌中的作用，为糖尿病心肌病的预防和治疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
从动物实验中心购买50只雄性SD乳鼠，体质量（5～8）g，鼠龄1～3d。
1.1.2 实验试剂
MTT试剂盒，均购自美国西格玛公司;TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）;DMEM培养基（美国赛默飞公司）;逆转录引物（上海生工生物工程公司）;qPCR试剂盒;胎牛血清、胰蛋白酶（美国WISENT公司）以及相应目标蛋白多克隆抗体。
1.1.3 主要仪器
Westernblot显影及相关设备（美国BioRad公司）;实时定量PCR仪（美国BioRad公司）;细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）;Multiskan FC酶标仪;超净工作台（智城）。
1.2 实验方法
1.2.1 CFs的提取和培养
使用75%酒精对SD乳鼠进行消毒，转移至超净工作台上并固定，消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，快速置于双抗预冷的PBS溶液中，反复冲洗，并用剪刀剔除多余的结缔组织。将处理后的心脏置于新的无菌EP管中，充分剪碎心脏组织，将组织剪成约1mm3大小，EP管內加入3ml消化液（胰酶∶I型胶原酶=2∶1），在37℃水浴锅中消化5min，自然沉淀，弃上清，再加3ml消化液，与37℃水浴锅中消化20min（每隔2min振荡1次）。静置1min后小心吸取上清液至新的EP管中，并加入等量含血清的DMEM培养基终止消化。消化终止后再以900r·min1离心8分钟，弃上清液，加入适量DMEM培养基，吹匀重悬细胞，培养90min后换液，显微镜下观察细胞形态，贴壁生长的即为CFs。随后将细胞置入细胞培养箱中继续培养，连续传代2～3代后用于后续实验。
1.2.2 细胞实验分组
将CFs分别置于低糖浓度（葡萄糖浓度为5mmol·L1）培养基和高糖浓度（葡萄糖浓度为33.3mmol·L1）培养基培养，分为低糖组和高糖组。培养48～72h后分别提取蛋白质和总RNA进行后续实验。
1.2.3 各组细胞RNA提取及miR146a的检测
用TRIzol法，并根据操作手册提取细胞总RNA，紫外分光光度计测量RNA浓度，选用A260/A280在1.8～2.0间的RNA样本，逆转录的程序为25℃ 30min、42℃ 30min、85℃ 5min最后得到cDNA。设置反应条件为：预变性95℃ 10min;变性：95℃ 20s，退火;62℃ 30s延伸;72℃ 30s，共进行40个循环的扩增;熔解曲线阶段：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。检测miR146a表达的方法是以U6为内参，根据2ΔΔCT法计算各组mRNA相对表达量。qPCR检测αSMA、Col1A1、CXCR4表达。步骤如下：预变性阶段：50℃ 2min，95℃ 10min;扩增阶段95℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 30s，共进行40个循环;熔解曲线阶段95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s以GAPDH为内参，2ΔΔCT法计算各组mRNA相对表达量。
1.2.4 Westernblot法测定各组目标蛋白表达
细胞培养48h后，分别向低糖组和高糖组培养瓶中加入裂解液置冰上充分裂解细胞，收集各组细胞总蛋白，定量检测蛋白并配平。SDSPAGE电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭1h，TBST洗膜3次，每次10min，分别加入稀释的αSMA、Col1A1、CXCR4、GAPDH一抗，4℃孵育过夜。TBST洗膜10min×3次，室温孵育对应二抗2h。再洗膜3次，用ECL法显影，再使用ImageJ软件对显影结果分析，计算各组蛋白表达量。
1.2.5 MTT法检测心肌成纤维细胞增殖
乳鼠CFs提取后，分别置于低糖浓度培养基和高糖浓度培养基培养，调整细胞浓度至1×108·L1。然后按每孔100μL接种于96孔板中，设置3～5个复孔。在培养24～48h后，不同时间点96孔板分别拿出，加入浓度为5g·L1的MTT溶液10μL，在加入MTT溶液后培养4h，弃去液体加入100μL DMSO，摇床振荡10min，测量OD值490mm处吸光度，实验重复3次。 1.3 统计学处理
采用SPSS 20.0统计软件进行分析，数据以x±s表示，单变量两组资料之间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。所有数据重复分析3次。
2 结果
2.1 高糖处理對CFs miR146a的表达影响
在高糖环境诱导CFs 48h后，qPCR检测各组miR146a的表达量结果如图1所示，低糖组高于高糖组（t=12.88，P<0.05），差异有统计学意义。
与低糖组相比：*P<0.05
2.2 高糖处理对CFs中目标蛋白mRNA表达的影响
CFs经过高糖培养培养48h后，qPCR检测各组目标蛋白相应mRNA的表达量，如图2所示，高糖组目标蛋白mRNA表达量均高于低糖组，差异有统计学意义（P<0.05）。
与低糖组相比：*P<0.05
2.3 高糖处理对CFs中目标蛋白表达的影响
各组目标蛋白的相对表达量，如图3所示。高糖组目标蛋白表达量高于低组，差异有统计学意义（P<0.05）。
与对低糖组相比：*P<0.05
2.4 高糖处理对CFs增殖活性的影响
MTT检测结果如图4所示，高糖诱导24h（P<0.05）和高糖诱导48h（P<0.05）后CFs增值水平高于低糖组，差异有统计学意义。
3 讨论
糖尿病是一种复杂的多系统疾病也是临床常见的代谢性疾病之一。无论1型还是2型糖尿病都会造成心脏微血管病变和心肌代谢紊乱所致的心肌广泛局灶性坏死[3]。糖尿病心肌病会导致心肌纤维化、心肌肥厚、氧化应激等病理改变[9]。其中，心肌纤维化是糖尿病心肌病最具有特征性的病理改变。心肌成纤维细胞的异常增殖和细胞外基质的沉积是造成心肌纤维化的直接原因[10]。有研究表明，高糖会促进心脏成纤维细胞产生胶原、纤维连接蛋白和TGFβ，从而加速心脏重构[11]。
MicroRNAs是一类高度保守的内源性非编码RNA，一般包含2022个核苷酸。它们的主要功能是通过与mRNA靶向结合，进而调控其降解或翻译，从而调控基因表达[3]。注射外源性miR146a后可通过抑制促纤维化因子释放和炎症通路激活抑制肾纤维化的发生、发展[12]。在肝纤维化中，miR146a可以通过作用于肝星状细胞的TGF/Smad和LPS/NFκB/Bambi信号通路阻断肝纤维化进程[5]。CXCR4是具有7个跨膜结构域的GTP蛋白藕联的跨膜受体，也是纤维细胞的主要趋化因子受体。特异性敲除小鼠巨噬细胞CXCR4基因，可阻止巨噬细胞通过SDF1/CXCR4轴趋化到肾间质中，缓解小鼠的肾间质纤维化程度[8]。PoYin Chu等人报道，CXCR4拮抗剂可减轻糖尿病心脏纤维化的发展[7]。
本研究在动物实验中结果显示，高糖诱导CFs后miR146a表达量较低糖组明显减少，而目标蛋白表达量却增高。MTT结果显示，高糖诱导后细胞增殖活性明显增高。本研究中，高糖处理CFs后，miR146a表达受抑制而CXCR4蛋白表达量增多，高糖能刺激CFs活化增殖。
综上所述，糖尿病心肌病CFs中，miR146a表达受到抑制，而CXCR4表达得到促进。可以猜测miR146a与CXCR4之间可能存在潜在的调节关系，但本研究尚处于初级探究阶段，仍需后期进行更深入研究。
参考文献：
[1]Jia G，Hill M A，Sowers J R.Diabetic Cardiomyopathy：
关键词：miR146a;CXCR4;糖尿病心肌病;心肌纤维化
中图分类号：R 542.23
To investigate the expression changes ofMicroRNA146a and CXCR4
in myocardial tissue and fibroblasts of diabetic cardiomyopathy
Wang Can1，2 Tao Hui1，2 Jiang Shumei1，2 Wang Lichao1，2 Shi Kaihu1，2*
1.Dept of Cardiothoracic Surgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University AnhuiHefei 230601;
2.Cardiovascular Research Center，Anhui Medical University AnhuiHefei 230601
Abstract：Objective：To investigate the expression changes of microRNA146a （miR146a） and chemokine receptor 4 （CXCR4） in diabetic cardiomyopathy myocardial fibroblasts （CFS）.Methods：CFS were extracted and high glucose （33.3mmol·L1） was used to induce CFs.Use qRTPCR in the detection of CFs miR146a express，Western blotting detection in CFs the expression of αSMA，Col1A1，and CXCR4.MTT was used to detect the effect of high glucose on the proliferation of CFS.Results：Compared with the normal control group，the expression of miR146a decreased in CFs induced by high glucose，while the expression of αSMA，Col1A1 and CXCR4 increased in CFs induced by high glucose.The proliferation activity of CFs was increased after high glucose treatment.Conclusion：During the formation of diabetic cardiomyopathy，miR146a expression is downregulated in CFs，while CXCR4 expression is upregulated，suggesting that there may be a potential regulatory relationship between miR146a and CXCR4 in the course of diabetic cardiomyopathy，which is helpful to explore the pathological mechanism of diabetic cardiomyopathy. Keywords：miR146a;CXCR4;Diabetic cardiomyopathy;Myocardial fibrosis
糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy，DCM）是指在没有其他心脏危险因素如冠状动脉疾病、瓣膜病或高血压等疾病的影响下，因糖尿病而损伤心肌造成心脏结构和功能异常[1]。高血糖会诱导心肌成纤维细胞异常增殖和细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的沉积加速心肌纤维化（Myocardial fibrosis，MF）进程，最终导致心功能不全[2]。MicroRNAs是一类内源性非编码小RNA，长度一般在22～23个核苷酸序列[3]，研究表明，有多种miRNAs参与调控糖尿病心肌纤维化的进程[4]。据报道，miR146a参与了肝纤维化的进程[5]。CXCR4是一类趋化因子受体[6]，CXCR4在纤维化方面的作用也多有报道[78]。本研究，通过细胞实验观察miR146a与CXCR4在糖尿病心肌病CFs中的表达变化，探究其在糖尿病心肌中的作用，为糖尿病心肌病的预防和治疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
从动物实验中心购买50只雄性SD乳鼠，体质量（5～8）g，鼠龄1～3d。
1.1.2 实验试剂
MTT试剂盒，均购自美国西格玛公司;TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）;DMEM培养基（美国赛默飞公司）;逆转录引物（上海生工生物工程公司）;qPCR试剂盒;胎牛血清、胰蛋白酶（美国WISENT公司）以及相应目标蛋白多克隆抗体。
1.1.3 主要仪器
Westernblot显影及相关设备（美国BioRad公司）;实时定量PCR仪（美国BioRad公司）;细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）;Multiskan FC酶标仪;超净工作台（智城）。
1.2 实验方法
1.2.1 CFs的提取和培养
使用75%酒精对SD乳鼠进行消毒，转移至超净工作台上并固定，消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，快速置于双抗预冷的PBS溶液中，反复冲洗，并用剪刀剔除多余的结缔组织。将处理后的心脏置于新的无菌EP管中，充分剪碎心脏组织，将组织剪成约1mm3大小，EP管內加入3ml消化液（胰酶∶I型胶原酶=2∶1），在37℃水浴锅中消化5min，自然沉淀，弃上清，再加3ml消化液，与37℃水浴锅中消化20min（每隔2min振荡1次）。静置1min后小心吸取上清液至新的EP管中，并加入等量含血清的DMEM培养基终止消化。消化终止后再以900r·min1离心8分钟，弃上清液，加入适量DMEM培养基，吹匀重悬细胞，培养90min后换液，显微镜下观察细胞形态，贴壁生长的即为CFs。随后将细胞置入细胞培养箱中继续培养，连续传代2～3代后用于后续实验。
1.2.2 细胞实验分组
将CFs分别置于低糖浓度（葡萄糖浓度为5mmol·L1）培养基和高糖浓度（葡萄糖浓度为33.3mmol·L1）培养基培养，分为低糖组和高糖组。培养48～72h后分别提取蛋白质和总RNA进行后续实验。
1.2.3 各组细胞RNA提取及miR146a的检测
用TRIzol法，并根据操作手册提取细胞总RNA，紫外分光光度计测量RNA浓度，选用A260/A280在1.8～2.0间的RNA样本，逆转录的程序为25℃ 30min、42℃ 30min、85℃ 5min最后得到cDNA。设置反应条件为：预变性95℃ 10min;变性：95℃ 20s，退火;62℃ 30s延伸;72℃ 30s，共进行40个循环的扩增;熔解曲线阶段：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。检测miR146a表达的方法是以U6为内参，根据2ΔΔCT法计算各组mRNA相对表达量。qPCR检测αSMA、Col1A1、CXCR4表达。步骤如下：预变性阶段：50℃ 2min，95℃ 10min;扩增阶段95℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 30s，共进行40个循环;熔解曲线阶段95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s以GAPDH为内参，2ΔΔCT法计算各组mRNA相对表达量。
1.2.4 Westernblot法测定各组目标蛋白表达
细胞培养48h后，分别向低糖组和高糖组培养瓶中加入裂解液置冰上充分裂解细胞，收集各组细胞总蛋白，定量检测蛋白并配平。SDSPAGE电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭1h，TBST洗膜3次，每次10min，分别加入稀释的αSMA、Col1A1、CXCR4、GAPDH一抗，4℃孵育过夜。TBST洗膜10min×3次，室温孵育对应二抗2h。再洗膜3次，用ECL法显影，再使用ImageJ软件对显影结果分析，计算各组蛋白表达量。
1.2.5 MTT法检测心肌成纤维细胞增殖
乳鼠CFs提取后，分别置于低糖浓度培养基和高糖浓度培养基培养，调整细胞浓度至1×108·L1。然后按每孔100μL接种于96孔板中，设置3～5个复孔。在培养24～48h后，不同时间点96孔板分别拿出，加入浓度为5g·L1的MTT溶液10μL，在加入MTT溶液后培养4h，弃去液体加入100μL DMSO，摇床振荡10min，测量OD值490mm处吸光度，实验重复3次。 1.3 统计学处理
采用SPSS 20.0统计软件进行分析，数据以x±s表示，单变量两组资料之间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。所有数据重复分析3次。
2 结果
2.1 高糖处理對CFs miR146a的表达影响
在高糖环境诱导CFs 48h后，qPCR检测各组miR146a的表达量结果如图1所示，低糖组高于高糖组（t=12.88，P<0.05），差异有统计学意义。
与低糖组相比：*P<0.05
2.2 高糖处理对CFs中目标蛋白mRNA表达的影响
CFs经过高糖培养培养48h后，qPCR检测各组目标蛋白相应mRNA的表达量，如图2所示，高糖组目标蛋白mRNA表达量均高于低糖组，差异有统计学意义（P<0.05）。
与低糖组相比：*P<0.05
2.3 高糖处理对CFs中目标蛋白表达的影响
各组目标蛋白的相对表达量，如图3所示。高糖组目标蛋白表达量高于低组，差异有统计学意义（P<0.05）。
与对低糖组相比：*P<0.05
2.4 高糖处理对CFs增殖活性的影响
MTT检测结果如图4所示，高糖诱导24h（P<0.05）和高糖诱导48h（P<0.05）后CFs增值水平高于低糖组，差异有统计学意义。
3 讨论
糖尿病是一种复杂的多系统疾病也是临床常见的代谢性疾病之一。无论1型还是2型糖尿病都会造成心脏微血管病变和心肌代谢紊乱所致的心肌广泛局灶性坏死[3]。糖尿病心肌病会导致心肌纤维化、心肌肥厚、氧化应激等病理改变[9]。其中，心肌纤维化是糖尿病心肌病最具有特征性的病理改变。心肌成纤维细胞的异常增殖和细胞外基质的沉积是造成心肌纤维化的直接原因[10]。有研究表明，高糖会促进心脏成纤维细胞产生胶原、纤维连接蛋白和TGFβ，从而加速心脏重构[11]。
MicroRNAs是一类高度保守的内源性非编码RNA，一般包含2022个核苷酸。它们的主要功能是通过与mRNA靶向结合，进而调控其降解或翻译，从而调控基因表达[3]。注射外源性miR146a后可通过抑制促纤维化因子释放和炎症通路激活抑制肾纤维化的发生、发展[12]。在肝纤维化中，miR146a可以通过作用于肝星状细胞的TGF/Smad和LPS/NFκB/Bambi信号通路阻断肝纤维化进程[5]。CXCR4是具有7个跨膜结构域的GTP蛋白藕联的跨膜受体，也是纤维细胞的主要趋化因子受体。特异性敲除小鼠巨噬细胞CXCR4基因，可阻止巨噬细胞通过SDF1/CXCR4轴趋化到肾间质中，缓解小鼠的肾间质纤维化程度[8]。PoYin Chu等人报道，CXCR4拮抗剂可减轻糖尿病心脏纤维化的发展[7]。
本研究在动物实验中结果显示，高糖诱导CFs后miR146a表达量较低糖组明显减少，而目标蛋白表达量却增高。MTT结果显示，高糖诱导后细胞增殖活性明显增高。本研究中，高糖处理CFs后，miR146a表达受抑制而CXCR4蛋白表达量增多，高糖能刺激CFs活化增殖。
综上所述，糖尿病心肌病CFs中，miR146a表达受到抑制，而CXCR4表达得到促进。可以猜测miR146a与CXCR4之间可能存在潜在的调节关系，但本研究尚处于初级探究阶段，仍需后期进行更深入研究。
参考文献：
[1]Jia G，Hill M A，Sowers J R.Diabetic Cardiomyopathy：