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摘要 采用纤维素酶法辅助提取姜辣素，确定姜辣素最优提取工艺条件;将提取出的姜辣素用于清除亚硝酸盐，确定最优清除条件。结果表明，姜辣素最优提取工艺条件为酶添加量1.4%、料液比1∶40、酶解温度65 ℃、酶解时间85 min，在该条件下平均提取率为2.61%;姜辣素清除亚硝酸盐的最优反应条件为添加5 μg/mL亚硝酸钠溶液2.0 mL，姜辣素浓度15 mg/mL、反应温度80 ℃、反应时间20 min、姜辣素添加量4.5 mL，在该条件下平均清除率为98.74%。
关键词 生姜;姜辣素;提取率;亚硝酸盐;清除率
中图分类号 TS-201.2 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）13-0175-05
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.044
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Study on Extraction Process of Gingerols and Its Nitrite Scavenging Effect
LI Mi，CHEN Shang long，ZHANG Jian ping et al
（Key Laboratory of Food Resources Development and Quality Safety in Jiangsu Province，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou，Jiangsu 221008）
Abstract The optimum extraction conditions of gingerol were determined by cellulase assisted extraction，and the optimal removal conditions were determined when gingerol was used for nitrite removal.The results showed that the optimum extraction conditions of gingerol were as follows： enzyme dosage 1.4%，solid liquid ratio 1∶40，the digestion temperature was 65 ℃ for 85 min.Under these conditions，the average extraction rate was 2.61%.The optimal reaction conditions were： adding 2.0 mL 5 μg/ mL sodium nitrite solution，15 mg / mL gingerol concentration，80 ℃，20 min reaction time and 4.5 mL gingerol addition.Under these conditions，the average removal rate was 98.74%.
Key words Ginger;Gingerol;Extraction rate;Nitrite;Clearance rate
生姜具有药食同源的特征，生姜在提升食物风味的同时，还具有抗氧化、抗肿瘤等作用，对于治疗呕吐、感冒、咳嗽有显著的效果[1-2]。根据刘丹等[3]的研究，构成生姜姜辣素的物质种类丰富，将姜酚、姜酮酚、姜烯酚等具有辛辣味的非挥发性成分统称为姜辣素。其中，姜酚常常会因为失去水分而形成姜烯酚或者發生反应生成姜酮[4-6]。由于生姜中的纤维素含量较高，因此在提取姜辣素时，如何突破生姜细胞壁纤维素结构的制约是一大难题。酶法辅助提取可以溶解和软化生姜的细胞壁，使细胞结构变得疏松，从而提高姜辣素的提取率。
亚硝酸盐是一种常用的食品添加剂，适量的亚硝酸盐可使食品的颜色和光泽得到长时间保持，延长储存时间。但是过量的亚硝酸盐导致人体缺氧，造成头晕、昏迷，甚至丧失生命[7-8];亚硝酸盐可以促进蛋白质羰基和二硫键的形成，进而造成肉类蛋白质的氧化[9-10];还可以生成亚硝胺，具有致癌作用[11]。亚硝酸盐的清除方法有多种，其中葱、姜、蒜等菜蔬的提取溶液对该物质具有较强的清除作用。
目前，有关于采用酶法辅助提取姜辣素，研究其对亚硝酸盐的清除作用鲜有报道。笔者以生姜为原料，采用纤维素酶法辅助提取姜辣素，研究最优提取工艺及其清除亚硝酸盐的最优条件，以期为天然亚硝酸盐清除剂的开发生产提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生姜（购自徐州市世纪华联超市）：清洗干净后切成薄片，于电热鼓风干燥箱中干燥，用粉碎机磨成粉，过网筛备用。
纤维素酶（10万U/g），和氏璧生物科技有限公司;香草醛（≥ 99%），西陇科学化工;无水乙醇、亚硝酸钠（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司;对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺（均为分析纯），阿拉丁试剂有限公司。
1.2 仪器与设备 DHG-9075A电热鼓风干燥箱，上海慧泰仪器制造有限公司;L550医用离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;HH-M4恒温水浴锅，上海赫田科学仪器有限公司;UV-2550紫外分光光度计，日本岛津;RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;195（A65412906）真空冷冻干燥机，美国LABCONCO公司;FA2004B电子天平，上海越平科学仪器有限公司;723C可见分光光度计，上海欣茂仪器设备有限公司。
1.3 方法 1.3.1 姜辣素的提取。
采用纤维素酶法辅助提取姜辣素，称取粉碎过筛的生姜粉0.1 g，加入一定质量的纤维素酶，将其溶解在一定体积的蒸馏水中，置于水浴锅内，在一定温度下提取一定时间，添加无水乙醇，于55 ℃萃取和沉淀25 min，之后置于离心机内，于4 000 r/min离心15 min，抽滤，得上清液备用。
1.3.2 香草醛标准曲线的绘制。制作200 μg/mL香草醛标准溶液：准确称取0.01 g香草醛置于容器中，量取50 mL无水乙醇对其进行充分溶解。分别量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL容量瓶中，用无水乙醇进行定容，充分摇匀。以无水乙醇为空白，在280 nm条件下测定吸光值，绘制标准曲线。
1.3.3 姜辣素提取率的测定。取“1.3.1”得到的上清液1 mL于10 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，充分摇匀后于280 nm测定，按下式计算姜辣素的提取率：
T（%）=（2.003×C×N×V）/（106×M）×100
式中，T为姜辣素的提取率，%;C为样品吸光值对应的香草醛浓度，μg/mL;N为样品的稀释倍数;M为生姜粉的质量，g;V为样品的体积， mL;2.003为香草醛与姜辣素之间的换算系数。
1.3.4 姜辣素粗提物粉末的制备。将姜辣素上清液置于旋转蒸发器内，温度调至50 ℃蒸发除去乙醇。剩余溶液置于冷冻干燥机中冷冻，得到姜辣素粉末。
1.3.5 亚硝酸盐清除率的测定。
准确称取一定质量的姜辣素粉末，量取一定体积的蒸馏水对其进行充分溶解，配成一定浓度的姜辣素溶液。取一定體积的姜辣素溶液，量取5 μg/mL NaNO2溶液2.0 mL加入其中，置于水浴锅内，在不同温度条件下反应一定时间。取出后立即量取0.4%对氨基苯磺酸2.0 mL加入其中，充分混匀，静置5 min，然后量取0.2% 盐酸萘乙二胺溶液1.0 mL加入其中，静置15 min，使其进行充分反应。取1 mL该溶液置于10 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容，充分摇匀后于538 nm条件下测定吸光值（A），同时以蒸馏水代替NaNO2溶液作为空白对照进行测定，吸光值用A01表示，以蒸馏水代替姜辣素溶液作为空白对照进行测定，吸光值用A02表示，姜辣素对亚硝酸盐的清除率按下式计算[12]：
Q（%）=（A02+A01-A）/A02×100
式中，Q为亚硝酸盐的清除率，%;A为样品的吸光值;A01为以蒸馏水代替NaNO2溶液空白对照的吸光值;A02为蒸馏水代替姜辣素溶液空白对照的吸光值。
1.4 纤维素酶法辅助提取姜辣素的最优工艺条件研究
1.4.1 单因素试验。
1.4.1.1 酶添加量对提取效果的影响。
称取生姜粉末0.1 g，酶添加量分别为0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%（以生姜粉质量计，即分别添加纤维素酶0.000 6、0.001 0、0.001 4、0.001 8、0.002 2 g），将其溶解于8.5 mL蒸馏水中，即料液比为1∶85 （生姜粉质量∶蒸馏水体积，g/ mL），置于恒温水浴锅内，酶解温度为45 ℃，酶解时间为85 min，确定最佳酶添加量。
1.4.1.2 料液比对提取效果的影响。
称取生姜粉末0.1 g，纤维素酶添加量为1.4%，分别将其溶解在料液比为1∶25、1∶40、1∶55、1∶70、1∶85（g/mL）的蒸馏水中，置于恒温水浴锅内，酶解温度为45 ℃，酶解时间为85 min，确定最佳料液比。
1.4.1.3 酶解温度对提取效果的影响。
称取生姜粉末0.1 g，纤维素酶添加量为1.4%，将其溶解在5.5 mL蒸馏水中，料液比为1∶55，置于水浴锅内，分别在25、35、45、55、65 ℃下提取85 min，确定酶解温度。
1.4.1.4 酶解时间对提取效果的影响。
称取生姜粉末0.1 g，纤维素酶添加量为1.4%，将其溶解在5.5 mL蒸馏水中，料液比为1∶55，置于恒温水浴锅内，酶解温度为55 ℃，分别提取25、55、85、115、145 min，确定酶解时间。
1.4.2 正交试验。根据单因素试验结果设计4因素3水平L9（34）的正交试验（表1），筛选最佳工艺条件。
1.5 姜辣素清除亚硝酸盐的最优条件研究
1.5.1 单因素试验。
1.5.1.1 姜辣素浓度对清除效果的影响。
分别制作浓度为5、10、15、20、25 mg/mL的姜辣素溶液，取3.5 mL加入2 mL 5 μg/mL亚硝酸钠溶液，混匀后置于水浴锅内，温度调至55 ℃，加热15 min，确定最佳浓度。
1.5.1.2 温度对清除效果的影响。配制15 mg/mL姜辣素溶液，取3.5 mL加入2 mL 5 μg/mL亚硝酸钠溶液，充分混合后置于水浴锅内，温度分别调至40、55、70、85、100 ℃，反应时间为15 min，确定最佳反应温度。
1.5.1.3 时间对清除效果的影响。
配制15 mg/mL姜辣素溶液，取3.5 mL加入2 mL 5 μg/mL亚硝酸钠溶液，充分混合后置于水浴锅内，温度调至70 ℃，反应时间分别为5、10、15、20、25 min，确定最佳反应时间。
1.5.1.4 姜辣素添加量对清除效果的影响。
配制15 mg/mL姜辣素溶液，分别取1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mL，加入2 mL 5 μg/mL亚硝酸钠溶液，混合均匀后置于70 ℃恒温水浴锅内15 min，确定姜辣素的最佳添加量。 1.5.2 正交试验。
根据单因素试验结果设计4因素3水平L9（34）正交试验，筛选姜辣素清除亚硝酸盐的最佳条件（表2）。
2 结果与分析
2.1 香草醛标准曲线 根据“1.3.2”方法，得出标准曲线如图1所示。由图1可知，回归方程为y=0.069 3x-0.013 4，R2=0.999 3。
2.2 纤维素酶法辅助提取姜辣素的最优工艺条件
2.2.1 单因素试验结果。
2.2.1.1 酶添加量对提取效果的影响。由图2可知，当酶添加量为1.4%时，提取率最高。当酶添加量较低时，难以完全提取出姜辣素，提取率较低。酶添加量高于1.4%时，提取率反而下降，这是由于对纤维素酶的提取量达到饱和状态[13]。因此，选择1.4%作为最优酶添加量。
2.2.1.2 料液比对提取效果的影响。由图3可知，当料液比为1∶55时，提取率最高，提取效果最好。当料液比小于1∶55 时，随着料液比的增大，提取率逐渐增大。当料液比大于1∶55时，提取率反而下降，这是由于当料液比达到1∶55时，已经基本达到饱和，添加过量的蒸馏水不仅会降低提取率，还会吸收热量，增加热能的消耗，增大了其他工艺的难度[14-16]。因此，选择1∶55作为最优料液比。
2.2.1.3 酶解温度对提取效果的影响。由图4可知，当酶解温度为55 ℃时，提取率最高。这是由于当温度较低时，酶解作用不彻底，因此提取率较低。当温度逐渐达到纤维素酶的最适温度时，酶解作用完全，并且高温条件下，分子运动速度大大提升，细胞膜的结构发生变化，能够提取出更多的姜辣素。然而，当温度大于55 ℃时，酶的活性降低，提取效果有所减弱[17]。因此，选择55 ℃作为最优酶解温度。
2.2.1.4 酶解时间对提取效果的影响。由图5可知，当酶解时间为115 min时，提取率最高，提取效果最好。这是由于纤维素酶的活力随着酶解时间的增加逐渐提升，酶解作用完全，能够提取出更多的姜辣素，由此提取率提高[18]。当酶解到达一定时间，姜辣素几乎完全被提取出来，再延长时间，提取率反而有所下降。因此，选择115 min作为最优酶解时间。
2.2.2 正交试验结果。根据极差值可知这4个因素对姜辣
素提取效果的影响程度，由表3可知，影响程度由高到低依
次为料液比、酶添加量、酶解温度、酶解时间。方差分析表明，4个因素对提取效果的影响程度均达到极显著水平（P<0.01）。由此确定纤维素酶法辅助提取姜辣素的最优工艺条件为酶添加量1.4%，料液比1∶40，酶解温度65 ℃，酶解時间85 min。在该条件下重复试验3次，平均提取率为2.61%。
2.3 姜辣素清除亚硝酸盐的最优反应条件
2.3.1 单因素试验结果。
2.3.1.1 姜辣素浓度对亚硝酸盐清除效果的影响。由图6可知，当姜辣素浓度为15 mg/mL时，对亚硝酸盐的清除率最高，清除效果最好。当浓度低于15 mg/mL时，清除率果随着姜辣素浓度的升高而提高，当浓度高于15 mg/mL时，清除率反而降低，清除效果逐渐减弱。因此，选择15 mg/mL作为最优姜辣素浓度。
2.3.1.2 温度对亚硝酸盐清除效果的影响。由图7可知，当温度高于70 ℃时，清除率变化不大。当温度低于70 ℃时，清除率随着温度的升高而增大，这是由于较高的反应温度使分子运动的速度大大提升，促进了姜辣素与亚硝酸盐发生反应，从而提高了亚硝酸盐的清除率。因此，选择70 ℃作为最优反应温度。
2.3.1.3 时间对亚硝酸盐清除效果的影响。由图8可知，当反应时间为15 min时，姜辣素对亚硝酸盐清除率最高，清除效果最好。当时间小于15 min时，清除率随着时间的推移而提高。这是由于当反应时间为15 min时，姜辣素与亚硝酸盐的反应较为彻底，因此对亚硝酸盐的清除率达到最高，超过15 min，对亚硝酸盐的清除率反而有所降低。因此，选择15 min作为最优反应时间。
2.3.1.4 姜辣素添加量对亚硝酸盐清除效果的影响。由图9可知，当姜辣素添加量为3.5 mL时，清除率最高，清除效果最好。当姜辣素添加量小于3.5 mL时，清除率随着添加量的增大而提高，当添加量大于3.5 mL时，清除率反而降低。因此，选择3.5 mL作为最优姜辣素添加量。
2.3.2 正交试验结果。根据极差值可以看出姜辣素浓度、反应温度、反应时间、姜辣素添加量这4个因素对清除效果的影响程度，由表4可知，影响程度由高到低依次为反应时间、反应温度、姜辣素添加量、姜辣素浓度。方差分析表明，4个因素对清除效果的影响程度均达到极显著水平（P<0.01）。由此确定姜辣素清除亚硝酸盐的最优反应条件为姜辣素浓度15 mg/mL，反应温度80 ℃，反应时间20 min，姜辣素添加量4.5 mL。在该条件下试验重复3次，平均清除率为98.74%。
3 结论
近年来，许多天然源植物提取物陆续被证明可作为有效的亚硝酸盐清除剂与亚硝胺合成阻断剂，主要活性成分包括酚类、还原糖和多糖类、维生素类、氧化还原酶类等多种化学类型[19-23]。该试验采用纤维素酶法辅助提取姜辣素，确定了姜辣素的最优提取工艺条件及姜辣素清除亚硝酸盐的最优反应条件。在最优工艺条件下姜辣素平均提取率为2.61%，亚硝酸盐的平均清除率可达98.74%，说明姜辣素可作为一种高效的亚硝酸盐清除剂应用于食品工业。
参考文献
[1]
曾高峰，张志勇，鲁力，等.生姜提取物对阿尔茨海默病大鼠动物炎症因子的影响[J].广东医学，2013，34（7）：1014-1016.
[2] 生姜饮料系列产品加工技术[J].农产品加工，2013（1）：77. [3] 刘丹，张程慧，安容慧，等.生姜主要生物活性成分提取及应用研究进展[J].食品工业科技，2016，37（20）：391-395，400.
[4] 韩燕全，洪燕，李钰馨，等.UPLC法测定不同产地炮姜药材中5种姜酚类成分的含量[J].山西中医学院学报，2015，16（3）：30-32.
[5] OFFEI OKNYE R，PATTERSON J，WALKER L T，et al.Processing effects on phytochemical content and antioxidative potential of ginger Zingiber officale[J].Food and nutrition sciences，2015，6（5）：445-451.
[6] 孟喜成.RP-HPLC法测定干姜、炮姜和生姜中3种姜酚的含量[J].中国药房，2011，22（23）：2182-2184.
[7] 郭一凡.浅谈亚硝酸盐的危害[J].微量元素与健康研究，2012，29（6）：73-74.
[8] 朱效兵，石晶红.亚硝酸盐与人体健康[J].河套大学学报，2007，4（4）：66-69.
[9] VILLAVERDE A，MORCUENDE D，ESTVEZ M.Effect of curing agents on the oxidative and nitrosative damage to meat proteins during processing of fermented sausages[J].Journal of food science，2014，79（7）：C1331-C1342.
[10] FENG X C，LI C Y，JIA X，et al.Influence of sodium nitrite on protein oxidation and nitrosation of sausages subjected to processing and storage[J].Meat science，2016，116：260-267.
[11] 皇甫超申，許靖华，秦明周，等.亚硝酸盐与癌的关系[J].河南大学学报（自然科学版），2009，39（1）：35-41.
[12] 盛玮，高翔，薛建平，等.黑糯玉米色素清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究[J].食品科学，2013，34（17）：92-95.
[13] 李孚杰，潘丹贞，张丛兰，等.纤维素酶法提取板栗壳色素的工艺条件优化[J].食品科学，2012，33（2）：149-153.
[14] 项敏，郭嘉，刘竞博，等.姜辣素提取与分离纯化工艺的研究进展[J].化学与生物工程，2015，32（5）：7-10.
[15] 杜秋叶，李赫，蔡成岗，等.超声波辅助提取生姜中姜辣素的工艺研究[J].广州化工，2014，42（15）：73-75.
[16] 汤秀华，周郑虹.微波辅助萃取法从生姜中提取姜辣素的工艺[J].食品研究与开发，2012，33（8）：88-91.
[17] 叶丽红，王标诗，程漪婷，等.水酶法提取番木瓜籽油工艺及其氧化稳定性分析[J].食品科学，2014，35（16）：58-63.
[18] 王琛，石太渊.双酶酶解法提取姜油树脂工艺优化[J].食品科学，2011，32（12）：60-63.
[19] 李桂星，胡晓丹，孙红男，等.模拟胃液条件下苹果多酚对亚硝酸盐的清除作用[J].食品科学，2011，32（11）：1-4.
[20] 李玲，张汆，周光宏，等.植物多酚对模拟胃酸体系中亚硝酸盐清除能力与亚硝胺生成的影响[J].南京农业大学学报，2013，36（3）：111-116.
[21] 赵二劳，杨勤帅，郝丽琴，等.南瓜黄色素阻断亚硝胺合成与抑菌活性研究[J].分析科学学报，2016，32（5）：701-704.
[22] 盛玮，高翔，薛建平，等.黑糯玉米色素清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究[J].食品科学，2013，34（17）：92-95.
[23] 周斯仪，袁颖雅，黄晓桦，等.模拟胃液条件下假蒟叶提取物抑制亚硝化反应的研究[J].安徽农业科学，2014，42（29）：10326-10327，10330.
关键词 生姜;姜辣素;提取率;亚硝酸盐;清除率
中图分类号 TS-201.2 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）13-0175-05
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.044
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Study on Extraction Process of Gingerols and Its Nitrite Scavenging Effect
LI Mi，CHEN Shang long，ZHANG Jian ping et al
（Key Laboratory of Food Resources Development and Quality Safety in Jiangsu Province，Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou，Jiangsu 221008）
Abstract The optimum extraction conditions of gingerol were determined by cellulase assisted extraction，and the optimal removal conditions were determined when gingerol was used for nitrite removal.The results showed that the optimum extraction conditions of gingerol were as follows： enzyme dosage 1.4%，solid liquid ratio 1∶40，the digestion temperature was 65 ℃ for 85 min.Under these conditions，the average extraction rate was 2.61%.The optimal reaction conditions were： adding 2.0 mL 5 μg/ mL sodium nitrite solution，15 mg / mL gingerol concentration，80 ℃，20 min reaction time and 4.5 mL gingerol addition.Under these conditions，the average removal rate was 98.74%.
Key words Ginger;Gingerol;Extraction rate;Nitrite;Clearance rate
生姜具有药食同源的特征，生姜在提升食物风味的同时，还具有抗氧化、抗肿瘤等作用，对于治疗呕吐、感冒、咳嗽有显著的效果[1-2]。根据刘丹等[3]的研究，构成生姜姜辣素的物质种类丰富，将姜酚、姜酮酚、姜烯酚等具有辛辣味的非挥发性成分统称为姜辣素。其中，姜酚常常会因为失去水分而形成姜烯酚或者發生反应生成姜酮[4-6]。由于生姜中的纤维素含量较高，因此在提取姜辣素时，如何突破生姜细胞壁纤维素结构的制约是一大难题。酶法辅助提取可以溶解和软化生姜的细胞壁，使细胞结构变得疏松，从而提高姜辣素的提取率。
亚硝酸盐是一种常用的食品添加剂，适量的亚硝酸盐可使食品的颜色和光泽得到长时间保持，延长储存时间。但是过量的亚硝酸盐导致人体缺氧，造成头晕、昏迷，甚至丧失生命[7-8];亚硝酸盐可以促进蛋白质羰基和二硫键的形成，进而造成肉类蛋白质的氧化[9-10];还可以生成亚硝胺，具有致癌作用[11]。亚硝酸盐的清除方法有多种，其中葱、姜、蒜等菜蔬的提取溶液对该物质具有较强的清除作用。
目前，有关于采用酶法辅助提取姜辣素，研究其对亚硝酸盐的清除作用鲜有报道。笔者以生姜为原料，采用纤维素酶法辅助提取姜辣素，研究最优提取工艺及其清除亚硝酸盐的最优条件，以期为天然亚硝酸盐清除剂的开发生产提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生姜（购自徐州市世纪华联超市）：清洗干净后切成薄片，于电热鼓风干燥箱中干燥，用粉碎机磨成粉，过网筛备用。
纤维素酶（10万U/g），和氏璧生物科技有限公司;香草醛（≥ 99%），西陇科学化工;无水乙醇、亚硝酸钠（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司;对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺（均为分析纯），阿拉丁试剂有限公司。
1.2 仪器与设备 DHG-9075A电热鼓风干燥箱，上海慧泰仪器制造有限公司;L550医用离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;HH-M4恒温水浴锅，上海赫田科学仪器有限公司;UV-2550紫外分光光度计，日本岛津;RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;195（A65412906）真空冷冻干燥机，美国LABCONCO公司;FA2004B电子天平，上海越平科学仪器有限公司;723C可见分光光度计，上海欣茂仪器设备有限公司。
1.3 方法 1.3.1 姜辣素的提取。
采用纤维素酶法辅助提取姜辣素，称取粉碎过筛的生姜粉0.1 g，加入一定质量的纤维素酶，将其溶解在一定体积的蒸馏水中，置于水浴锅内，在一定温度下提取一定时间，添加无水乙醇，于55 ℃萃取和沉淀25 min，之后置于离心机内，于4 000 r/min离心15 min，抽滤，得上清液备用。
1.3.2 香草醛标准曲线的绘制。制作200 μg/mL香草醛标准溶液：准确称取0.01 g香草醛置于容器中，量取50 mL无水乙醇对其进行充分溶解。分别量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL容量瓶中，用无水乙醇进行定容，充分摇匀。以无水乙醇为空白，在280 nm条件下测定吸光值，绘制标准曲线。
1.3.3 姜辣素提取率的测定。取“1.3.1”得到的上清液1 mL于10 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，充分摇匀后于280 nm测定，按下式计算姜辣素的提取率：
T（%）=（2.003×C×N×V）/（106×M）×100
式中，T为姜辣素的提取率，%;C为样品吸光值对应的香草醛浓度，μg/mL;N为样品的稀释倍数;M为生姜粉的质量，g;V为样品的体积， mL;2.003为香草醛与姜辣素之间的换算系数。
1.3.4 姜辣素粗提物粉末的制备。将姜辣素上清液置于旋转蒸发器内，温度调至50 ℃蒸发除去乙醇。剩余溶液置于冷冻干燥机中冷冻，得到姜辣素粉末。
1.3.5 亚硝酸盐清除率的测定。
准确称取一定质量的姜辣素粉末，量取一定体积的蒸馏水对其进行充分溶解，配成一定浓度的姜辣素溶液。取一定體积的姜辣素溶液，量取5 μg/mL NaNO2溶液2.0 mL加入其中，置于水浴锅内，在不同温度条件下反应一定时间。取出后立即量取0.4%对氨基苯磺酸2.0 mL加入其中，充分混匀，静置5 min，然后量取0.2% 盐酸萘乙二胺溶液1.0 mL加入其中，静置15 min，使其进行充分反应。取1 mL该溶液置于10 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容，充分摇匀后于538 nm条件下测定吸光值（A），同时以蒸馏水代替NaNO2溶液作为空白对照进行测定，吸光值用A01表示，以蒸馏水代替姜辣素溶液作为空白对照进行测定，吸光值用A02表示，姜辣素对亚硝酸盐的清除率按下式计算[12]：
Q（%）=（A02+A01-A）/A02×100
式中，Q为亚硝酸盐的清除率，%;A为样品的吸光值;A01为以蒸馏水代替NaNO2溶液空白对照的吸光值;A02为蒸馏水代替姜辣素溶液空白对照的吸光值。
1.4 纤维素酶法辅助提取姜辣素的最优工艺条件研究
1.4.1 单因素试验。
1.4.1.1 酶添加量对提取效果的影响。
称取生姜粉末0.1 g，酶添加量分别为0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%（以生姜粉质量计，即分别添加纤维素酶0.000 6、0.001 0、0.001 4、0.001 8、0.002 2 g），将其溶解于8.5 mL蒸馏水中，即料液比为1∶85 （生姜粉质量∶蒸馏水体积，g/ mL），置于恒温水浴锅内，酶解温度为45 ℃，酶解时间为85 min，确定最佳酶添加量。
1.4.1.2 料液比对提取效果的影响。
称取生姜粉末0.1 g，纤维素酶添加量为1.4%，分别将其溶解在料液比为1∶25、1∶40、1∶55、1∶70、1∶85（g/mL）的蒸馏水中，置于恒温水浴锅内，酶解温度为45 ℃，酶解时间为85 min，确定最佳料液比。
1.4.1.3 酶解温度对提取效果的影响。
称取生姜粉末0.1 g，纤维素酶添加量为1.4%，将其溶解在5.5 mL蒸馏水中，料液比为1∶55，置于水浴锅内，分别在25、35、45、55、65 ℃下提取85 min，确定酶解温度。
1.4.1.4 酶解时间对提取效果的影响。
称取生姜粉末0.1 g，纤维素酶添加量为1.4%，将其溶解在5.5 mL蒸馏水中，料液比为1∶55，置于恒温水浴锅内，酶解温度为55 ℃，分别提取25、55、85、115、145 min，确定酶解时间。
1.4.2 正交试验。根据单因素试验结果设计4因素3水平L9（34）的正交试验（表1），筛选最佳工艺条件。
1.5 姜辣素清除亚硝酸盐的最优条件研究
1.5.1 单因素试验。
1.5.1.1 姜辣素浓度对清除效果的影响。
分别制作浓度为5、10、15、20、25 mg/mL的姜辣素溶液，取3.5 mL加入2 mL 5 μg/mL亚硝酸钠溶液，混匀后置于水浴锅内，温度调至55 ℃，加热15 min，确定最佳浓度。
1.5.1.2 温度对清除效果的影响。配制15 mg/mL姜辣素溶液，取3.5 mL加入2 mL 5 μg/mL亚硝酸钠溶液，充分混合后置于水浴锅内，温度分别调至40、55、70、85、100 ℃，反应时间为15 min，确定最佳反应温度。
1.5.1.3 时间对清除效果的影响。
配制15 mg/mL姜辣素溶液，取3.5 mL加入2 mL 5 μg/mL亚硝酸钠溶液，充分混合后置于水浴锅内，温度调至70 ℃，反应时间分别为5、10、15、20、25 min，确定最佳反应时间。
1.5.1.4 姜辣素添加量对清除效果的影响。
配制15 mg/mL姜辣素溶液，分别取1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mL，加入2 mL 5 μg/mL亚硝酸钠溶液，混合均匀后置于70 ℃恒温水浴锅内15 min，确定姜辣素的最佳添加量。 1.5.2 正交试验。
根据单因素试验结果设计4因素3水平L9（34）正交试验，筛选姜辣素清除亚硝酸盐的最佳条件（表2）。
2 结果与分析
2.1 香草醛标准曲线 根据“1.3.2”方法，得出标准曲线如图1所示。由图1可知，回归方程为y=0.069 3x-0.013 4，R2=0.999 3。
2.2 纤维素酶法辅助提取姜辣素的最优工艺条件
2.2.1 单因素试验结果。
2.2.1.1 酶添加量对提取效果的影响。由图2可知，当酶添加量为1.4%时，提取率最高。当酶添加量较低时，难以完全提取出姜辣素，提取率较低。酶添加量高于1.4%时，提取率反而下降，这是由于对纤维素酶的提取量达到饱和状态[13]。因此，选择1.4%作为最优酶添加量。
2.2.1.2 料液比对提取效果的影响。由图3可知，当料液比为1∶55时，提取率最高，提取效果最好。当料液比小于1∶55 时，随着料液比的增大，提取率逐渐增大。当料液比大于1∶55时，提取率反而下降，这是由于当料液比达到1∶55时，已经基本达到饱和，添加过量的蒸馏水不仅会降低提取率，还会吸收热量，增加热能的消耗，增大了其他工艺的难度[14-16]。因此，选择1∶55作为最优料液比。
2.2.1.3 酶解温度对提取效果的影响。由图4可知，当酶解温度为55 ℃时，提取率最高。这是由于当温度较低时，酶解作用不彻底，因此提取率较低。当温度逐渐达到纤维素酶的最适温度时，酶解作用完全，并且高温条件下，分子运动速度大大提升，细胞膜的结构发生变化，能够提取出更多的姜辣素。然而，当温度大于55 ℃时，酶的活性降低，提取效果有所减弱[17]。因此，选择55 ℃作为最优酶解温度。
2.2.1.4 酶解时间对提取效果的影响。由图5可知，当酶解时间为115 min时，提取率最高，提取效果最好。这是由于纤维素酶的活力随着酶解时间的增加逐渐提升，酶解作用完全，能够提取出更多的姜辣素，由此提取率提高[18]。当酶解到达一定时间，姜辣素几乎完全被提取出来，再延长时间，提取率反而有所下降。因此，选择115 min作为最优酶解时间。
2.2.2 正交试验结果。根据极差值可知这4个因素对姜辣
素提取效果的影响程度，由表3可知，影响程度由高到低依
次为料液比、酶添加量、酶解温度、酶解时间。方差分析表明，4个因素对提取效果的影响程度均达到极显著水平（P<0.01）。由此确定纤维素酶法辅助提取姜辣素的最优工艺条件为酶添加量1.4%，料液比1∶40，酶解温度65 ℃，酶解時间85 min。在该条件下重复试验3次，平均提取率为2.61%。
2.3 姜辣素清除亚硝酸盐的最优反应条件
2.3.1 单因素试验结果。
2.3.1.1 姜辣素浓度对亚硝酸盐清除效果的影响。由图6可知，当姜辣素浓度为15 mg/mL时，对亚硝酸盐的清除率最高，清除效果最好。当浓度低于15 mg/mL时，清除率果随着姜辣素浓度的升高而提高，当浓度高于15 mg/mL时，清除率反而降低，清除效果逐渐减弱。因此，选择15 mg/mL作为最优姜辣素浓度。
2.3.1.2 温度对亚硝酸盐清除效果的影响。由图7可知，当温度高于70 ℃时，清除率变化不大。当温度低于70 ℃时，清除率随着温度的升高而增大，这是由于较高的反应温度使分子运动的速度大大提升，促进了姜辣素与亚硝酸盐发生反应，从而提高了亚硝酸盐的清除率。因此，选择70 ℃作为最优反应温度。
2.3.1.3 时间对亚硝酸盐清除效果的影响。由图8可知，当反应时间为15 min时，姜辣素对亚硝酸盐清除率最高，清除效果最好。当时间小于15 min时，清除率随着时间的推移而提高。这是由于当反应时间为15 min时，姜辣素与亚硝酸盐的反应较为彻底，因此对亚硝酸盐的清除率达到最高，超过15 min，对亚硝酸盐的清除率反而有所降低。因此，选择15 min作为最优反应时间。
2.3.1.4 姜辣素添加量对亚硝酸盐清除效果的影响。由图9可知，当姜辣素添加量为3.5 mL时，清除率最高，清除效果最好。当姜辣素添加量小于3.5 mL时，清除率随着添加量的增大而提高，当添加量大于3.5 mL时，清除率反而降低。因此，选择3.5 mL作为最优姜辣素添加量。
2.3.2 正交试验结果。根据极差值可以看出姜辣素浓度、反应温度、反应时间、姜辣素添加量这4个因素对清除效果的影响程度，由表4可知，影响程度由高到低依次为反应时间、反应温度、姜辣素添加量、姜辣素浓度。方差分析表明，4个因素对清除效果的影响程度均达到极显著水平（P<0.01）。由此确定姜辣素清除亚硝酸盐的最优反应条件为姜辣素浓度15 mg/mL，反应温度80 ℃，反应时间20 min，姜辣素添加量4.5 mL。在该条件下试验重复3次，平均清除率为98.74%。
3 结论
近年来，许多天然源植物提取物陆续被证明可作为有效的亚硝酸盐清除剂与亚硝胺合成阻断剂，主要活性成分包括酚类、还原糖和多糖类、维生素类、氧化还原酶类等多种化学类型[19-23]。该试验采用纤维素酶法辅助提取姜辣素，确定了姜辣素的最优提取工艺条件及姜辣素清除亚硝酸盐的最优反应条件。在最优工艺条件下姜辣素平均提取率为2.61%，亚硝酸盐的平均清除率可达98.74%，说明姜辣素可作为一种高效的亚硝酸盐清除剂应用于食品工业。
参考文献
[1]
曾高峰，张志勇，鲁力，等.生姜提取物对阿尔茨海默病大鼠动物炎症因子的影响[J].广东医学，2013，34（7）：1014-1016.
[2] 生姜饮料系列产品加工技术[J].农产品加工，2013（1）：77. [3] 刘丹，张程慧，安容慧，等.生姜主要生物活性成分提取及应用研究进展[J].食品工业科技，2016，37（20）：391-395，400.
[4] 韩燕全，洪燕，李钰馨，等.UPLC法测定不同产地炮姜药材中5种姜酚类成分的含量[J].山西中医学院学报，2015，16（3）：30-32.
[5] OFFEI OKNYE R，PATTERSON J，WALKER L T，et al.Processing effects on phytochemical content and antioxidative potential of ginger Zingiber officale[J].Food and nutrition sciences，2015，6（5）：445-451.
[6] 孟喜成.RP-HPLC法测定干姜、炮姜和生姜中3种姜酚的含量[J].中国药房，2011，22（23）：2182-2184.
[7] 郭一凡.浅谈亚硝酸盐的危害[J].微量元素与健康研究，2012，29（6）：73-74.
[8] 朱效兵，石晶红.亚硝酸盐与人体健康[J].河套大学学报，2007，4（4）：66-69.
[9] VILLAVERDE A，MORCUENDE D，ESTVEZ M.Effect of curing agents on the oxidative and nitrosative damage to meat proteins during processing of fermented sausages[J].Journal of food science，2014，79（7）：C1331-C1342.
[10] FENG X C，LI C Y，JIA X，et al.Influence of sodium nitrite on protein oxidation and nitrosation of sausages subjected to processing and storage[J].Meat science，2016，116：260-267.
[11] 皇甫超申，許靖华，秦明周，等.亚硝酸盐与癌的关系[J].河南大学学报（自然科学版），2009，39（1）：35-41.
[12] 盛玮，高翔，薛建平，等.黑糯玉米色素清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究[J].食品科学，2013，34（17）：92-95.
[13] 李孚杰，潘丹贞，张丛兰，等.纤维素酶法提取板栗壳色素的工艺条件优化[J].食品科学，2012，33（2）：149-153.
[14] 项敏，郭嘉，刘竞博，等.姜辣素提取与分离纯化工艺的研究进展[J].化学与生物工程，2015，32（5）：7-10.
[15] 杜秋叶，李赫，蔡成岗，等.超声波辅助提取生姜中姜辣素的工艺研究[J].广州化工，2014，42（15）：73-75.
[16] 汤秀华，周郑虹.微波辅助萃取法从生姜中提取姜辣素的工艺[J].食品研究与开发，2012，33（8）：88-91.
[17] 叶丽红，王标诗，程漪婷，等.水酶法提取番木瓜籽油工艺及其氧化稳定性分析[J].食品科学，2014，35（16）：58-63.
[18] 王琛，石太渊.双酶酶解法提取姜油树脂工艺优化[J].食品科学，2011，32（12）：60-63.
[19] 李桂星，胡晓丹，孙红男，等.模拟胃液条件下苹果多酚对亚硝酸盐的清除作用[J].食品科学，2011，32（11）：1-4.
[20] 李玲，张汆，周光宏，等.植物多酚对模拟胃酸体系中亚硝酸盐清除能力与亚硝胺生成的影响[J].南京农业大学学报，2013，36（3）：111-116.
[21] 赵二劳，杨勤帅，郝丽琴，等.南瓜黄色素阻断亚硝胺合成与抑菌活性研究[J].分析科学学报，2016，32（5）：701-704.
[22] 盛玮，高翔，薛建平，等.黑糯玉米色素清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究[J].食品科学，2013，34（17）：92-95.
[23] 周斯仪，袁颖雅，黄晓桦，等.模拟胃液条件下假蒟叶提取物抑制亚硝化反应的研究[J].安徽农业科学，2014，42（29）：10326-10327，10330.