论文部分内容阅读
摘 要 下载Aspergillus niger ATCC 1015菌株全基因组序列，利用GRAMENE网站提供的SSR鉴定工具SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool），并按含有2～10个碱基重复、碱基数在18 bp以上的SSR基元为标准进行SSR鉴定。结果从A. niger ATCC 1015全基因组中，共发现4 000个2～10碱基SSR，其中含9个碱基重复基元类型最多，共有1 433个，占所鉴定SSR总数的35.8%。其次为6个碱基重复基元类型，共有753个，占SSR总数的18.8%；接着为3个碱基重复类型，共有547个，占13.6%。从鉴定出来的SSR中，选择含有SSR的合适区段，从中设计了36对引物，对剑麻茎腐病菌17个菌株的基因组DNA进行了PCR检测，发现这些引物都能从剑麻茎腐病菌基因组DNA中有效扩增。由此表明，黑曲霉ATCC 1015菌株基因组SSR在剑麻茎腐病菌基因组中具有通用性。这为研究剑麻茎腐病菌群体遗传变异、多样性和进化，定位和克隆功能基因等提供了分子标记。
关键词 黑曲霉；剑麻；SSR标记
中图分类号 Q78；S432.4 文献标识码 A
Development of Genomic SSR Markers for
Aspergillus niger from Sisal
WU Weihuai1， HE Chunping1 *， YAN Chuandi2， ZHENG Jinlong1
LI Rui1， ZHENG Xiaolan1， LIU Qiaolian3， YI Kexian1 *
1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory for Monitoring and Control of
Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests / Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical
Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China
2 College of Environment and Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
3 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou，Hainan 571101
Abstract Simple sequence repeat identification tool was used to screen SSRs in complete genome sequence of Aspergillus niger ATCC 1015. Suitable sequence regions harboring SSR were selected for primers design using Primer5.0 software， and synthesized primers were used to amplify genomic DNA of selected 17 isolates of A. niger from sisal. A total of 4 000 SSRs were found in A. niger ATCC 1015. Of the 4 000 SSRs， the most abundant SSR was the non-nucleotide type， with the SSR numbers being 1 433， followed by the hexa- and tri- nucleotide ones， being 753 and 547， respectively. A set of 36 SSR markers were developed from the genomic sequence of the reference isolate A. niger ATCC 1015. These markers were amplified successfully from the genomic DNAs of A. niger from sisal. Therefore， the markers are useful to analyses genetic mutation， diversity and， evolution of sisal A. niger， and also useful for gene mapping and cloning in the pathogens.
Key words Aspergillus niger； Sisal； Simple sequence repeat（SSR）
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.024
利用分子标记技术从基因组水平了解病原真菌变异及其遗传多样性对于防治植物病原真菌有着重要意义。随着分子生物学技术的快速发展，许多分子标记如RAPD、SRAP、AFLP、SSR等已广泛用于病原菌群体遗传变异与遗传多样性分析。在此类标记当中，SSR标记又由于其具有在基因组中分布广，侧翼序列相对保守，多态性好，标记多呈共现性，操作简单，重复性好等诸多优点而普遍受到欢迎。该标记已成为病原菌群体遗传结构、群体进化、遗传多样性，分子发育等研究的重要工具[1-3]。目前的研究结果表明，从原核生物到人类基因组均含有丰富而高度多态性的SSR[4]。近年来，随着生物基因组的大规模测序的开展，GenBank中已存贮了大量不同生物类型的基因组DNA序列，这为SSR标记开发提供了丰富的DNA序列来源。 黑曲霉是一种广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中的曲霉属真菌，是一类重要的致病真菌，同时也是重要的发酵工业菌种。目前该菌已有产酶菌株CBS 513.88和产柠檬酸菌株ATCC 1015等2个工业菌株分别获得了全基因组序列，前者于2007年完成测序[5]，而后者于2011年完成测序[6]。比较而言，后者基因组序列更加完善[6]。
由黑曲霉菌（Aspergillus niger Van. Teigh）引起的茎腐病是剑麻最严重的病害之一[7-9]。上世纪80年代，该病曾在我国粤西地区造成了严重的经济损失[10]。近年来，该病在我国剑麻主产区呈现愈来愈加重之势。为此，本研究拟利用ATCC 1015全基因组序列，首先对其进行全基因组SSR搜索，寻找并开发合适的SSR标记，并用于剑麻茎腐病菌基因组DNA扩增，以期为该病原菌群体进化和遗传多样性分析，致病相关基因等的精细定位研究等提供理想的分析工具。
1 材料与方法
1.1 材料
从（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）网站下载A. niger ATCC 1015菌株全基因组序列（ACJE
00000000）。
1.1.1 供试菌株 用于本研究的17个剑麻茎腐病菌株其具体信息详见表1。
1.2 方法
1.2.1 黑曲霉全基因组SSR位点筛选 利用GRAMENE网站（http：//www.gramene.org/db/markers/ssrtool）提供的SSR鉴定工具SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）进行SSR鉴定。SSR鉴定标准为含有2～10个碱基重复、碱基数在18 bp 以上的SSR 基元，也即含2、3、4、5、6、7、8、9和10核苷酸基元SSR的最小重复数分别为9、6、5、4、3、3、3、2和2次。
1.2.2 引物设计 对鉴定出的各SSR进行比较，选取含有碱基数较大的SSR的核苷酸序列，在其基元上下游合适的位置，用软件primer5.0设计引物。引物一般要求GC含量40%～65%，Tm值55～65 ℃，引物序列长18～25 bp，且无错配、不形成二聚体和发夹结构等。设计好的引物最终由Invitrogen公司合成。
1.2.3 引物的有效性评价 引物的有效性通过对收集于我国不同剑麻栽培区的17个菌株进行评价。标记开发成功的标准即为：供筛选的引物只要在17个剑麻茎腐病菌株中的任一个中扩增出有效条带即为有效引物，而在17个菌株中扩增出不同DNA大小片段的则记为多态性标记。
1.2.4 剑麻茎腐病菌株及DNA提取 各参试菌株的总DNA采用DNA提取试剂盒（E.Z.N.A Fungal DNA kit，Omega公司，美国）提取。
1.2.5 PCR扩增及产物检测 PCR反应体系为20 μL，含有20～30 ng DNA模板，10 μL 2×Eco Taq PCR Super Mix，上下游引物各0.5 μL（10.0 μmol/L），ddH2O补齐。PCR反应在Mastercycler gradient Mastercycler PCR扩增仪上进行，扩增程序为：94 ℃预变性3 min；随后94 ℃变性30 s，55～60℃退火30 s（根据所用引物的Tm值确定退火温度），72 ℃延伸30 s，扩增35个循环；最后72℃延伸5 min，10 ℃保存。PCR扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下检测和照相。
1.2.6 克隆与测序 回收PCR产物并与pEASYTM Cloning Vector连接，转化大肠杆菌感受态细胞，经蓝白斑筛选后，选取阳性克隆子送Invitrogen公司测序。获得的序列经人工去除载体序列后，利用多序列比对软件工具（http：//multalin.toulouse.inra.fr/multalin/），将所获得的序列与参考菌株A. niger ATCC 1015对应序列进行比对。
2 结果与分析
2.1 黑曲霉菌基因组SSR查询分析
利用SSRIT软件对A. niger ATCC 1015菌株全基因组进行SSR搜索，结果共发现4 000个SSR（表2）。在这4 000个SSR中，其中9个碱基重复基元类型最多，共有1 433个，占所鉴定SSR总数的35.8%；其次为6个碱基重复基元类型，共有753个，占SSR总数的18.8%；接着为3个碱基重复类型，共有547个，占13.6%。而数量较少的则为7与8碱基类型，二者分别为85与68个；接着为5、2、4碱基基元类型，分别为194、282及286个（表2）。
2.2 SSR筛选与引物设计
由于SSR多态性密切相关其基元重复数[11]，而且重复数越高，其变异概率越大[12-13]。为此，通过对已鉴定的4 000个SSR进一步进行比较分析，从中筛选出碱基基元数与重复数乘积数较大的SSR （重复类型的总核苷酸数较大的SSR），并在其上下游设计引物。最终，从筛选出来的SSR中共设计了36对SSR引物，36对SSR引物分布于24个测序支架中的17个（表3）。
2.3 引物有效性检测
为了检测已设计的36对SSR引物在剑麻茎腐病菌中的存在情况。分别对17个剑麻茎腐病菌DNA进行了PCR扩增。结果表明，所设计的36对引物均能在剑麻茎腐病菌基因组DNA中有效扩增（图1）。其中具有多态性的19对引物均能扩增出2个及以上的等位基因，占总引物数的52.7%。如引物AN5-1扩增的条带中既有大小的差异，也有存在与缺失（有或无条带）的多态（图1-B）；引物An8-1扩增出来的条带中存在明显的大小差异（图1-C）；而引物AN21-1在17个供试菌株中均能扩增出唯一条带（图1-F）；由引物An14-1及引物An17-1等扩增出来的条带中存在明显的条带大小差异多态性（1-D，1-E）。故基于A. niger ATCC 1015菌株序列所开发剑麻茎腐病菌同源SSR标记是可行的。 2.4 茎腐病菌SSR的PCR产物序列分析
为了进一步验证所开发的SSR标记的真实性，选取An5-1引物并对CH0002、CH0008、CH0009菌株DNA进行扩增，进而对其扩增产物进行克隆与测序。将获得的序列与A. niger ATCC 1015菌株对应序列进行比对。序列分析结果表明，与参考菌株A. niger ATCC 1015中（act）22 基元相比，在CH0002、CH0008、CH0009菌株中则均缺失了一个（act）10基元（图2）。由此表明，该处SSR的位点是真实存在的。除此之外，3个菌株其序列在SSR基元区中还存在6个核苷酸变异，这就表明，剑麻茎腐病病原菌与A. niger ATCC 1015菌株间存在一定的差异。另一方面，就CH0002、CH0008、CH0009菌株序列而言，在该处SSR位点没有差异，但在其侧翼序列存在一个（GCT）3的差异。尽管如此，茎腐病菌与A. niger ATCC 1015序列仍然拥有非常高的同源性。由此表明，根据其开发的SSR在剑麻茎腐病菌中具有真实性和通用性。
3 讨论
随着生物技术的不断发展，尤其是高通量测序技术的出现，越来越多的生物基因组被破译。如何充分利用这些基因组的序列信息是后基因组时代的重要课题。而从这些已知基因组中查询核苷酸序列已成为快速、有效开发SSR标记的途径。目前，已有2个黑曲霉菌株进行了全基因组测序，这为从黑曲霉基因组中开发剑麻茎腐病SSR标记提供了可能。本研究利用黑曲霉ATCC 1015菌株基因组为参考序列，从中共鉴定到4 000个2～10碱基SSR，进而选择重复次数比较多的36个位点设计引物，通过17个剑麻茎腐病菌基因组DNA检测发现，36对引物均能从供试菌株中有效扩增。其中19对引物具有多态性，占总引物数的52.7%。由此，一方面说明利用该基因组来开发剑麻茎腐病菌基因组SSR具有可行性，另一方面也说明该方法具有高效性。进一步的测序验证了参考菌株序列与剑麻茎腐病菌具有高度的同源性。这为将来开发更多具有多态性的SSR分子标记提供了可能。
在本研究所鉴定出的SSR中，其中含9个碱基重复基元类型最多，共有1 433个，占所鉴定SSR总数的35.8%。其次为6个碱基重复基元类型，共有753个，占SSR总数的18.8%；接着为3个碱基重复类型，共有547个，占13.6%。比较而言，在稻瘟病菌基因组中最丰富的是单碱基基元重复类型，其次为三碱基基元重复类型，以及五碱基重复核苷酸基元类型，数量最少的则是二核苷酸碱基类型[14]。在粗糙脉孢菌基因组中，其中数量最多的是三碱基SSR，数量达到4 729个，其次为六碱基SSR （2 940个）和单碱基SSR（2 489个）；而数量最少的是二碱基SSR[15]。然而，在构巢曲霉菌基因组中，最丰富的类型为五核苷酸基元类型，其次为六碱基以及三碱基类型，而最少的类型则是二核苷酸重复类型[16]。与之相似的，本研究中发现二碱基SSR也是属于比较少的。由此表明，不同病原菌基因组中SSR类型存在明显差异，但也可能与鉴定SSR时所设定的标准不同有一定的关系[17]。
迄今为止，虽然已在稻瘟病菌、粗糙脉孢菌、构巢曲霉菌以及禾谷镰刀菌等多种病原菌中开发出了SSR标记[14-15，17]，但是据笔者所了解，对剑麻茎腐病菌进行SSR标记开发，尚属首次。这为研究剑麻茎腐病菌遗传变异、遗传多样性、进化以及功能基因的定位和克隆等提供了有效的分子标记。
参考文献
[1] Atallah Z K， Larget B， Chen X， et al. High genetic diversity， phenotypic uniformity， and evidence of outcrossing in Sclerotinia sclerotiorum in the Columbia Basin of Washington State[J]. Phytopathology， 2004， 94： 737-742
[2] Li Y C， Korol A B， Fahima T， et al. Microsatellites within genes： structure， function， and evolution[J]. Mol Biol Evol， 2004， 21： 991-1 007
[3] Ivors K， Garbelotto M， Vries I D， et al. Microsatellite markers identify three lineages of Phytophthora ramorum in US nurseries， yet single lineages in US forest and European nursery populations[J]. Mol Ecol， 2006， 15： 1 493-1 505
[4] Field D， Wills C. A bundant microsatellite polymorphism in Saccharomyces cerevisiae， and the different distributions of microsatellites in eight prokaryotes and S. cerevisiae， result from strong mutation pressures and a variety of selective forces[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1998， 95： 1 647-1 652.
[5] Pel H J， de Winde J H， Archer D B， et al. Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88[J]. Nature biotechnology， 2007， 25（2）： 221-231. [6] Andersen M R， Salazar M P， Schaap P J. Comparative genomics of citric-acid-producing Aspergillus niger ATCC 1015 versus enzyme-producing CBS 513.88[J]. Genome Res. 2011， 21： 885-897.
[7] 郑服丛， 黎乙东. 剑麻茎腐病病原生物学特性的研究[J]. 热带作物学报， 1992， 13（1）： 79-85.
[8] 李道和. 剑麻栽培[M]. 北京： 中国农业出版社， 1998.
[9] 孙光明. 剑麻栽培工程[M]. 北京： 中国农业出版社， 2007.
[10] 黄 标， 符清华. H.11648麻茎腐病发生规律及防治研究[J]. 热带作物研究， 1990（3）：38 -45.
[11] Cho Y G， Ishii T， Temnykh S， et al. Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and GenBank sequences in rice （Oryza sativa L.）[J]. Thero Appl Genet， 2000， 100： 713-722.
[12] Upupa S M， Robertson L D， Weigand F， et al. Allelic variation at（TTA）n microsatellite loci in a word collection of chickpea （Cicer arietinum L.）germplasm[J]. Mol Gen Genomics， 1999， 261： 354-363.
[13] Burstin J， Deniot G， Potier J， et al. Microsatellite polymorphism in Pisum sativum[J]. Plant Breed， 2001， 120： 311-317.
[14] 李成云， 李进斌， 周晓罡， 等. 稻瘟病菌基因组中微卫星序列的频率和分布[J]. 中国水稻科学， 2004， 18（3）： 269-273.
[15] 李成云， 李进斌， 周晓罡， 等. 粗糙脉孢菌基因组中的微卫星序列的组成和分布[J]. 中国农业科学， 2004， 37（6）： 851-858.
[16] 李成云， 李进斌， 周晓罡， 等. 构巢曲霉菌基因组中的数量可变重复序列的组成和分布[J]. 遗传学报， 2005， 32（5）： 538-544.
[17] Feng S J， Ma J H， Lin F， et al. Construction of an electronic physical map of Magnaporthe oryzae using genomic position-ready SSR markers[J]. Chinese Science Bulletin， 2007， 52（24）： 3 346-3 354.
关键词 黑曲霉；剑麻；SSR标记
中图分类号 Q78；S432.4 文献标识码 A
Development of Genomic SSR Markers for
Aspergillus niger from Sisal
WU Weihuai1， HE Chunping1 *， YAN Chuandi2， ZHENG Jinlong1
LI Rui1， ZHENG Xiaolan1， LIU Qiaolian3， YI Kexian1 *
1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory for Monitoring and Control of
Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests / Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical
Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China
2 College of Environment and Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
3 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou，Hainan 571101
Abstract Simple sequence repeat identification tool was used to screen SSRs in complete genome sequence of Aspergillus niger ATCC 1015. Suitable sequence regions harboring SSR were selected for primers design using Primer5.0 software， and synthesized primers were used to amplify genomic DNA of selected 17 isolates of A. niger from sisal. A total of 4 000 SSRs were found in A. niger ATCC 1015. Of the 4 000 SSRs， the most abundant SSR was the non-nucleotide type， with the SSR numbers being 1 433， followed by the hexa- and tri- nucleotide ones， being 753 and 547， respectively. A set of 36 SSR markers were developed from the genomic sequence of the reference isolate A. niger ATCC 1015. These markers were amplified successfully from the genomic DNAs of A. niger from sisal. Therefore， the markers are useful to analyses genetic mutation， diversity and， evolution of sisal A. niger， and also useful for gene mapping and cloning in the pathogens.
Key words Aspergillus niger； Sisal； Simple sequence repeat（SSR）
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.024
利用分子标记技术从基因组水平了解病原真菌变异及其遗传多样性对于防治植物病原真菌有着重要意义。随着分子生物学技术的快速发展，许多分子标记如RAPD、SRAP、AFLP、SSR等已广泛用于病原菌群体遗传变异与遗传多样性分析。在此类标记当中，SSR标记又由于其具有在基因组中分布广，侧翼序列相对保守，多态性好，标记多呈共现性，操作简单，重复性好等诸多优点而普遍受到欢迎。该标记已成为病原菌群体遗传结构、群体进化、遗传多样性，分子发育等研究的重要工具[1-3]。目前的研究结果表明，从原核生物到人类基因组均含有丰富而高度多态性的SSR[4]。近年来，随着生物基因组的大规模测序的开展，GenBank中已存贮了大量不同生物类型的基因组DNA序列，这为SSR标记开发提供了丰富的DNA序列来源。 黑曲霉是一种广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中的曲霉属真菌，是一类重要的致病真菌，同时也是重要的发酵工业菌种。目前该菌已有产酶菌株CBS 513.88和产柠檬酸菌株ATCC 1015等2个工业菌株分别获得了全基因组序列，前者于2007年完成测序[5]，而后者于2011年完成测序[6]。比较而言，后者基因组序列更加完善[6]。
由黑曲霉菌（Aspergillus niger Van. Teigh）引起的茎腐病是剑麻最严重的病害之一[7-9]。上世纪80年代，该病曾在我国粤西地区造成了严重的经济损失[10]。近年来，该病在我国剑麻主产区呈现愈来愈加重之势。为此，本研究拟利用ATCC 1015全基因组序列，首先对其进行全基因组SSR搜索，寻找并开发合适的SSR标记，并用于剑麻茎腐病菌基因组DNA扩增，以期为该病原菌群体进化和遗传多样性分析，致病相关基因等的精细定位研究等提供理想的分析工具。
1 材料与方法
1.1 材料
从（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）网站下载A. niger ATCC 1015菌株全基因组序列（ACJE
00000000）。
1.1.1 供试菌株 用于本研究的17个剑麻茎腐病菌株其具体信息详见表1。
1.2 方法
1.2.1 黑曲霉全基因组SSR位点筛选 利用GRAMENE网站（http：//www.gramene.org/db/markers/ssrtool）提供的SSR鉴定工具SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）进行SSR鉴定。SSR鉴定标准为含有2～10个碱基重复、碱基数在18 bp 以上的SSR 基元，也即含2、3、4、5、6、7、8、9和10核苷酸基元SSR的最小重复数分别为9、6、5、4、3、3、3、2和2次。
1.2.2 引物设计 对鉴定出的各SSR进行比较，选取含有碱基数较大的SSR的核苷酸序列，在其基元上下游合适的位置，用软件primer5.0设计引物。引物一般要求GC含量40%～65%，Tm值55～65 ℃，引物序列长18～25 bp，且无错配、不形成二聚体和发夹结构等。设计好的引物最终由Invitrogen公司合成。
1.2.3 引物的有效性评价 引物的有效性通过对收集于我国不同剑麻栽培区的17个菌株进行评价。标记开发成功的标准即为：供筛选的引物只要在17个剑麻茎腐病菌株中的任一个中扩增出有效条带即为有效引物，而在17个菌株中扩增出不同DNA大小片段的则记为多态性标记。
1.2.4 剑麻茎腐病菌株及DNA提取 各参试菌株的总DNA采用DNA提取试剂盒（E.Z.N.A Fungal DNA kit，Omega公司，美国）提取。
1.2.5 PCR扩增及产物检测 PCR反应体系为20 μL，含有20～30 ng DNA模板，10 μL 2×Eco Taq PCR Super Mix，上下游引物各0.5 μL（10.0 μmol/L），ddH2O补齐。PCR反应在Mastercycler gradient Mastercycler PCR扩增仪上进行，扩增程序为：94 ℃预变性3 min；随后94 ℃变性30 s，55～60℃退火30 s（根据所用引物的Tm值确定退火温度），72 ℃延伸30 s，扩增35个循环；最后72℃延伸5 min，10 ℃保存。PCR扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下检测和照相。
1.2.6 克隆与测序 回收PCR产物并与pEASYTM Cloning Vector连接，转化大肠杆菌感受态细胞，经蓝白斑筛选后，选取阳性克隆子送Invitrogen公司测序。获得的序列经人工去除载体序列后，利用多序列比对软件工具（http：//multalin.toulouse.inra.fr/multalin/），将所获得的序列与参考菌株A. niger ATCC 1015对应序列进行比对。
2 结果与分析
2.1 黑曲霉菌基因组SSR查询分析
利用SSRIT软件对A. niger ATCC 1015菌株全基因组进行SSR搜索，结果共发现4 000个SSR（表2）。在这4 000个SSR中，其中9个碱基重复基元类型最多，共有1 433个，占所鉴定SSR总数的35.8%；其次为6个碱基重复基元类型，共有753个，占SSR总数的18.8%；接着为3个碱基重复类型，共有547个，占13.6%。而数量较少的则为7与8碱基类型，二者分别为85与68个；接着为5、2、4碱基基元类型，分别为194、282及286个（表2）。
2.2 SSR筛选与引物设计
由于SSR多态性密切相关其基元重复数[11]，而且重复数越高，其变异概率越大[12-13]。为此，通过对已鉴定的4 000个SSR进一步进行比较分析，从中筛选出碱基基元数与重复数乘积数较大的SSR （重复类型的总核苷酸数较大的SSR），并在其上下游设计引物。最终，从筛选出来的SSR中共设计了36对SSR引物，36对SSR引物分布于24个测序支架中的17个（表3）。
2.3 引物有效性检测
为了检测已设计的36对SSR引物在剑麻茎腐病菌中的存在情况。分别对17个剑麻茎腐病菌DNA进行了PCR扩增。结果表明，所设计的36对引物均能在剑麻茎腐病菌基因组DNA中有效扩增（图1）。其中具有多态性的19对引物均能扩增出2个及以上的等位基因，占总引物数的52.7%。如引物AN5-1扩增的条带中既有大小的差异，也有存在与缺失（有或无条带）的多态（图1-B）；引物An8-1扩增出来的条带中存在明显的大小差异（图1-C）；而引物AN21-1在17个供试菌株中均能扩增出唯一条带（图1-F）；由引物An14-1及引物An17-1等扩增出来的条带中存在明显的条带大小差异多态性（1-D，1-E）。故基于A. niger ATCC 1015菌株序列所开发剑麻茎腐病菌同源SSR标记是可行的。 2.4 茎腐病菌SSR的PCR产物序列分析
为了进一步验证所开发的SSR标记的真实性，选取An5-1引物并对CH0002、CH0008、CH0009菌株DNA进行扩增，进而对其扩增产物进行克隆与测序。将获得的序列与A. niger ATCC 1015菌株对应序列进行比对。序列分析结果表明，与参考菌株A. niger ATCC 1015中（act）22 基元相比，在CH0002、CH0008、CH0009菌株中则均缺失了一个（act）10基元（图2）。由此表明，该处SSR的位点是真实存在的。除此之外，3个菌株其序列在SSR基元区中还存在6个核苷酸变异，这就表明，剑麻茎腐病病原菌与A. niger ATCC 1015菌株间存在一定的差异。另一方面，就CH0002、CH0008、CH0009菌株序列而言，在该处SSR位点没有差异，但在其侧翼序列存在一个（GCT）3的差异。尽管如此，茎腐病菌与A. niger ATCC 1015序列仍然拥有非常高的同源性。由此表明，根据其开发的SSR在剑麻茎腐病菌中具有真实性和通用性。
3 讨论
随着生物技术的不断发展，尤其是高通量测序技术的出现，越来越多的生物基因组被破译。如何充分利用这些基因组的序列信息是后基因组时代的重要课题。而从这些已知基因组中查询核苷酸序列已成为快速、有效开发SSR标记的途径。目前，已有2个黑曲霉菌株进行了全基因组测序，这为从黑曲霉基因组中开发剑麻茎腐病SSR标记提供了可能。本研究利用黑曲霉ATCC 1015菌株基因组为参考序列，从中共鉴定到4 000个2～10碱基SSR，进而选择重复次数比较多的36个位点设计引物，通过17个剑麻茎腐病菌基因组DNA检测发现，36对引物均能从供试菌株中有效扩增。其中19对引物具有多态性，占总引物数的52.7%。由此，一方面说明利用该基因组来开发剑麻茎腐病菌基因组SSR具有可行性，另一方面也说明该方法具有高效性。进一步的测序验证了参考菌株序列与剑麻茎腐病菌具有高度的同源性。这为将来开发更多具有多态性的SSR分子标记提供了可能。
在本研究所鉴定出的SSR中，其中含9个碱基重复基元类型最多，共有1 433个，占所鉴定SSR总数的35.8%。其次为6个碱基重复基元类型，共有753个，占SSR总数的18.8%；接着为3个碱基重复类型，共有547个，占13.6%。比较而言，在稻瘟病菌基因组中最丰富的是单碱基基元重复类型，其次为三碱基基元重复类型，以及五碱基重复核苷酸基元类型，数量最少的则是二核苷酸碱基类型[14]。在粗糙脉孢菌基因组中，其中数量最多的是三碱基SSR，数量达到4 729个，其次为六碱基SSR （2 940个）和单碱基SSR（2 489个）；而数量最少的是二碱基SSR[15]。然而，在构巢曲霉菌基因组中，最丰富的类型为五核苷酸基元类型，其次为六碱基以及三碱基类型，而最少的类型则是二核苷酸重复类型[16]。与之相似的，本研究中发现二碱基SSR也是属于比较少的。由此表明，不同病原菌基因组中SSR类型存在明显差异，但也可能与鉴定SSR时所设定的标准不同有一定的关系[17]。
迄今为止，虽然已在稻瘟病菌、粗糙脉孢菌、构巢曲霉菌以及禾谷镰刀菌等多种病原菌中开发出了SSR标记[14-15，17]，但是据笔者所了解，对剑麻茎腐病菌进行SSR标记开发，尚属首次。这为研究剑麻茎腐病菌遗传变异、遗传多样性、进化以及功能基因的定位和克隆等提供了有效的分子标记。
参考文献
[1] Atallah Z K， Larget B， Chen X， et al. High genetic diversity， phenotypic uniformity， and evidence of outcrossing in Sclerotinia sclerotiorum in the Columbia Basin of Washington State[J]. Phytopathology， 2004， 94： 737-742
[2] Li Y C， Korol A B， Fahima T， et al. Microsatellites within genes： structure， function， and evolution[J]. Mol Biol Evol， 2004， 21： 991-1 007
[3] Ivors K， Garbelotto M， Vries I D， et al. Microsatellite markers identify three lineages of Phytophthora ramorum in US nurseries， yet single lineages in US forest and European nursery populations[J]. Mol Ecol， 2006， 15： 1 493-1 505
[4] Field D， Wills C. A bundant microsatellite polymorphism in Saccharomyces cerevisiae， and the different distributions of microsatellites in eight prokaryotes and S. cerevisiae， result from strong mutation pressures and a variety of selective forces[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1998， 95： 1 647-1 652.
[5] Pel H J， de Winde J H， Archer D B， et al. Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88[J]. Nature biotechnology， 2007， 25（2）： 221-231. [6] Andersen M R， Salazar M P， Schaap P J. Comparative genomics of citric-acid-producing Aspergillus niger ATCC 1015 versus enzyme-producing CBS 513.88[J]. Genome Res. 2011， 21： 885-897.
[7] 郑服丛， 黎乙东. 剑麻茎腐病病原生物学特性的研究[J]. 热带作物学报， 1992， 13（1）： 79-85.
[8] 李道和. 剑麻栽培[M]. 北京： 中国农业出版社， 1998.
[9] 孙光明. 剑麻栽培工程[M]. 北京： 中国农业出版社， 2007.
[10] 黄 标， 符清华. H.11648麻茎腐病发生规律及防治研究[J]. 热带作物研究， 1990（3）：38 -45.
[11] Cho Y G， Ishii T， Temnykh S， et al. Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and GenBank sequences in rice （Oryza sativa L.）[J]. Thero Appl Genet， 2000， 100： 713-722.
[12] Upupa S M， Robertson L D， Weigand F， et al. Allelic variation at（TTA）n microsatellite loci in a word collection of chickpea （Cicer arietinum L.）germplasm[J]. Mol Gen Genomics， 1999， 261： 354-363.
[13] Burstin J， Deniot G， Potier J， et al. Microsatellite polymorphism in Pisum sativum[J]. Plant Breed， 2001， 120： 311-317.
[14] 李成云， 李进斌， 周晓罡， 等. 稻瘟病菌基因组中微卫星序列的频率和分布[J]. 中国水稻科学， 2004， 18（3）： 269-273.
[15] 李成云， 李进斌， 周晓罡， 等. 粗糙脉孢菌基因组中的微卫星序列的组成和分布[J]. 中国农业科学， 2004， 37（6）： 851-858.
[16] 李成云， 李进斌， 周晓罡， 等. 构巢曲霉菌基因组中的数量可变重复序列的组成和分布[J]. 遗传学报， 2005， 32（5）： 538-544.
[17] Feng S J， Ma J H， Lin F， et al. Construction of an electronic physical map of Magnaporthe oryzae using genomic position-ready SSR markers[J]. Chinese Science Bulletin， 2007， 52（24）： 3 346-3 354.