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摘要：基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶（Gui-Lu-Er-Xian-Jiao， GLEXJ）治疗肿瘤放化疗后骨髓抑制（bone marrow suppression，BMS）的作用机制。运用TCMSP、TCMID数据库获取活性成分和作用靶点，在GeneCard、DisGeNET等数据库检索疾病靶点，成分靶点与疾病靶点映射后利用Cytoscape软件和STRING数据库构建GLEXJ“成分-靶点-疾病”调控网络与PPI网络，metescape数据库进行GO和KEGG富集分析。筛选得GLEXJ 86个活性成分，度值较高的化合物有槲皮素、山萘酚、豆甾醇、β-谷甾醇等，其作用于ESR1、RELA、EGFR、FOS、MAPK8、CCND1、NCOA2、NR3C1等89个关键靶点，这些靶点主要富集在MAPK、TNF、PI3K-Akt等与BMS相关的通路上。GLEXJ治疗BMS的作用体现了中药多成分、多靶点、多通路的特点，其机制可能与调控细胞增殖、调节细胞周期、调控氧化应激等多方面相关，本研究为后续研究提供一些思路和借鉴。
关键词：骨髓抑制;网络药理学;龟鹿二仙胶;作用机制;
近年来我国肿瘤的发病率不断攀升，而治疗手段中的多数抗癌药物和放、化疗在灭杀肿瘤细胞同时会让正常骨髓细胞受损，骨髓抑制是放、化疗后常见的限制性毒性反应，不但令患者身体状况恶化，甚至导致严重感染而增加死亡风险。中药作为辅助用药，以其疗效确切、副作用小等特點，在减缓BMS方面表现出良好的前景。
龟鹿二仙胶（GLEXJ）由龟板、鹿角胶、人参和枸杞组成，具有补益肝肾、填精益髓、助阳益气之功。有研究表明，GLEXJ能促进骨髓基质干细胞增殖并诱导其向成骨细胞分化[1];能减少细胞周期的阻滞，逆转化疗所致的骨髓造血干细胞（HSCs）衰老[2]。然而GLEXJ成分较为复杂，其治疗BMS的物质基础和作用机制尚未完全阐明。本研究将采用网络药理学方法初步阐释GLEXJ治疗BMS可能的作用机制，同时为临床更好地诊治BMS提供了一些参考与新思路。
1 材料与方法
1.1 成分检索及筛选靶点
运用TCMSP、TCMID数据库检索鹿角胶、龟板、人参、枸杞子的化学成分及作用靶点，根据口服生物利用度（0B）≥30%、药物相似性（DL）≥0.18筛选各活性成分。利用PubChem数据库得成分的SDF格式文件，导入至Swiss Target Prediction平台，进行反向药效团匹配预测化合物靶点，并设定“Probability>0.6”[6]的靶点作为关联性较高的潜在靶点，经规范、去重后得相应的靶点。
1.2 疾病靶点的获取及分子网络的构建分析
以“Bone Marrow Suppression”为关键词， 在DisGeNET、DiGSeE、GeneCards数据库获得BMS相关基因，剔除重复靶点，获取BMS相关的唯一靶点基因。利用Venny软件获取GLEXJ-BMS的交集靶点，通过Cytoscape软件构建GLEXJ“活性成分-靶点-疾病”网络，利用Network analyzer功能对网络中的拓扑属性进行分析。利用String数据库和Cytoscape软件构建PPI网络，根据各个节点的自由度，介度中心性和接近中心性等参数值对获得的映射网络进行筛选，获取得分前十的核心蛋白。
1.3 GO功能富集及KEGG通路富集分析
利用metascape数据库对核心靶点参与的生物学过程、信号通路进行分析，设置P≤0.01，获得GO功能及KEGG信号通路富集分析结果，利用 R语言绘制富集分析图。
2 结果
2.1 化合物成分的获取及筛选
通过TCMSP和TCMID数据库共获GLEXJ药物成分400个。经OB≥30%、DL≥0.18筛选后得有效成分共86个，其中人参22个，枸杞子45个，龟板20个，鹿角胶2个。利用TCMSP和Swiss Target Prediction平台共获取647个蛋白靶点，其中人参靶点为256个，枸杞子靶点为364个，龟板靶点为27个，鹿角胶靶点为0个，当中枸杞子成分槲皮素（quercetin）拥有154个潜在靶点。
2.2 疾病靶点的筛选及分子网络构建与分析
在GeneCards、DisGeNET、DigSee数据库得BMS相关靶点分别为6438个、39个、10个，3个数据库的结果合并、去重后得到6 448个靶点基因。将647个成分靶点与6448个BMS靶点进行映射，得共同靶点89个，借助Cytoscape软件构建“活性成分-靶点-疾病网络”，其中度值最大的5个成分为槲皮素、山萘酚、β-谷甾醇、豆甾醇、黄豆黄素。将89个交集靶点导入至STRING数据库，并利用 Cytoscape软件进行分析，从而获取PPI网络图，图中节点表示蛋白，边表示功能相关性，度值大小决定节点面积大小，节点面积越大表示蛋白在网络中所起的作用越大。筛选相关网络拓扑参数，其中居Degree值前十位的靶点依次为：ESR1、RELA、FOS、MAPK8、EGFR、CCND1、NR3C1、NCOA2、PRKCA、APP，这10个靶点被认为是GLEXJ治疗BMS的核心靶点。
2.3 GO功能分析及KEGG富集分析
将89个交集靶点应用metascape数据库进行相关富集分析，设置P≤0.01，依据P值筛选排名前20的GO-BP与KEGG富集结果，绘制富集分析图。共得到GO富集条目1541个，其中，生物过程条目1 372个，主要涉及调节细胞生长、细胞对激素刺激的反应等;分子功能条目104个，主要涉及转录因子结合、蛋白质结构域特异性结合等;细胞成分条目65个，主要涉及膜筏、膜微区等。共得139个KEGG富集条目，其中前20条信号通路依据KEGG BRITE层次分类，与疾病通路相关有16条，信号传导相关通路3条，1条与细胞过程相关通路。提示GLEXJ能通过多种疾病通路、信号通路及代谢通路对BMS发挥作用。 3 讨论
本研究应用网络药理学方法，从GLEXJ筛选出86个活性成分和647个潜在作用靶点，GLEXJ-BMS靶点达89个。通过分析“活性成分-靶点-疾病”调控网络，槲皮素、山萘酚、豆甾醇、β-谷甾醇等成分的靶点较多，推测是GLEXJ治疗BMS的主要成分。
在PPI网络中，发现核心靶蛋白为ESR1、RELA、EGFR、FOS、MAPK8、CCND1、NCOA2、NR3C1、APP、PRKCA，本研究发现GLEXJ作用于BMS的机制可大致分为2大类：①调控细胞周期与增殖方面，大剂量放化疗方案破坏骨髓基质细胞的细胞周期规律，如骨髓细胞的增殖和分化进程停滞或阻滞[4]，不能进入正常的细胞增殖，致使骨髓造血功能受阻。而细胞周期能否启动细胞增殖，关键的调控点在于G1与S期之间的调控点，CCND1是此调控点的细胞周期启动因子，路玫等[5]发现通过调控CCND1的表达，促进细胞由G1期-S期正常转化，能有效改善环磷酰胺化疗性BMS。与此同时，在富集分析中，GLEXJ成分与调节骨髓细胞分化、成骨、细胞生长调节等生物学过程，以及与骨髓细胞的分化、增殖周期等相关通路均能产生影响，从而影响造血功能。
②调控氧化应激方面：发生BMS的关键机制之一是HSCs衰老，而氧化损伤是细胞衰老的主流学说，HSCs自我更新与定向分化的平衡与抗氧化损伤有密切关系[6]。Sung等[7]发现通过调节MAPK通路，可缓解氧化应激，减缓BMS作用。
参考文献：
[1]牛素生，李楠，张燕，等.龟鹿二仙胶含药血清诱导大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的作用及机制[J].中国医药导报，2015，12（12）： 8-12+169.
[2]王珏，陈朝辉，邵科钉，等.龟鹿二仙胶逆转化疗诱导的造血干细胞衰老的机制研究[J].浙江中医药大学学报，2018，42（42）： 419-425.
[3]G David， G Aurélien， W Matthias， et al. SwissTargetPrediction： a web server for target prediction of bioactive small molecules[J]. 2014，42（42）：32-38.
[4]C J C r Sherr.The Pezcoller lecture： cancer cell cycles revisited[J].2000，60（60）：3689-3695.
[5]路玫，曹大明，赵喜新，等.针灸對环磷酰胺所致骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期调节蛋白Cyclin D1表达及细胞周期的动态影响[J].中国中西医结合杂志，2011，31（31）： 238-243.
[6]P Kirstetter， K Anderson， B T Porse， et al. Activation of the canonical Wnt pathway leads to loss of hematopoietic stem cell repopulation and multilineage differentiation block[J].2006，7（7）：1048-1056.
[7]S H Kim， I C Lee， J W Ko， et al. Diallyl Disulfide Prevents Cyclophosphamide-Induced Hemorrhagic Cystitis in Rats through the Inhibition of Oxidative Damage， MAPKs， and NF-κB Pathways[J].2015.
关键词：骨髓抑制;网络药理学;龟鹿二仙胶;作用机制;
近年来我国肿瘤的发病率不断攀升，而治疗手段中的多数抗癌药物和放、化疗在灭杀肿瘤细胞同时会让正常骨髓细胞受损，骨髓抑制是放、化疗后常见的限制性毒性反应，不但令患者身体状况恶化，甚至导致严重感染而增加死亡风险。中药作为辅助用药，以其疗效确切、副作用小等特點，在减缓BMS方面表现出良好的前景。
龟鹿二仙胶（GLEXJ）由龟板、鹿角胶、人参和枸杞组成，具有补益肝肾、填精益髓、助阳益气之功。有研究表明，GLEXJ能促进骨髓基质干细胞增殖并诱导其向成骨细胞分化[1];能减少细胞周期的阻滞，逆转化疗所致的骨髓造血干细胞（HSCs）衰老[2]。然而GLEXJ成分较为复杂，其治疗BMS的物质基础和作用机制尚未完全阐明。本研究将采用网络药理学方法初步阐释GLEXJ治疗BMS可能的作用机制，同时为临床更好地诊治BMS提供了一些参考与新思路。
1 材料与方法
1.1 成分检索及筛选靶点
运用TCMSP、TCMID数据库检索鹿角胶、龟板、人参、枸杞子的化学成分及作用靶点，根据口服生物利用度（0B）≥30%、药物相似性（DL）≥0.18筛选各活性成分。利用PubChem数据库得成分的SDF格式文件，导入至Swiss Target Prediction平台，进行反向药效团匹配预测化合物靶点，并设定“Probability>0.6”[6]的靶点作为关联性较高的潜在靶点，经规范、去重后得相应的靶点。
1.2 疾病靶点的获取及分子网络的构建分析
以“Bone Marrow Suppression”为关键词， 在DisGeNET、DiGSeE、GeneCards数据库获得BMS相关基因，剔除重复靶点，获取BMS相关的唯一靶点基因。利用Venny软件获取GLEXJ-BMS的交集靶点，通过Cytoscape软件构建GLEXJ“活性成分-靶点-疾病”网络，利用Network analyzer功能对网络中的拓扑属性进行分析。利用String数据库和Cytoscape软件构建PPI网络，根据各个节点的自由度，介度中心性和接近中心性等参数值对获得的映射网络进行筛选，获取得分前十的核心蛋白。
1.3 GO功能富集及KEGG通路富集分析
利用metascape数据库对核心靶点参与的生物学过程、信号通路进行分析，设置P≤0.01，获得GO功能及KEGG信号通路富集分析结果，利用 R语言绘制富集分析图。
2 结果
2.1 化合物成分的获取及筛选
通过TCMSP和TCMID数据库共获GLEXJ药物成分400个。经OB≥30%、DL≥0.18筛选后得有效成分共86个，其中人参22个，枸杞子45个，龟板20个，鹿角胶2个。利用TCMSP和Swiss Target Prediction平台共获取647个蛋白靶点，其中人参靶点为256个，枸杞子靶点为364个，龟板靶点为27个，鹿角胶靶点为0个，当中枸杞子成分槲皮素（quercetin）拥有154个潜在靶点。
2.2 疾病靶点的筛选及分子网络构建与分析
在GeneCards、DisGeNET、DigSee数据库得BMS相关靶点分别为6438个、39个、10个，3个数据库的结果合并、去重后得到6 448个靶点基因。将647个成分靶点与6448个BMS靶点进行映射，得共同靶点89个，借助Cytoscape软件构建“活性成分-靶点-疾病网络”，其中度值最大的5个成分为槲皮素、山萘酚、β-谷甾醇、豆甾醇、黄豆黄素。将89个交集靶点导入至STRING数据库，并利用 Cytoscape软件进行分析，从而获取PPI网络图，图中节点表示蛋白，边表示功能相关性，度值大小决定节点面积大小，节点面积越大表示蛋白在网络中所起的作用越大。筛选相关网络拓扑参数，其中居Degree值前十位的靶点依次为：ESR1、RELA、FOS、MAPK8、EGFR、CCND1、NR3C1、NCOA2、PRKCA、APP，这10个靶点被认为是GLEXJ治疗BMS的核心靶点。
2.3 GO功能分析及KEGG富集分析
将89个交集靶点应用metascape数据库进行相关富集分析，设置P≤0.01，依据P值筛选排名前20的GO-BP与KEGG富集结果，绘制富集分析图。共得到GO富集条目1541个，其中，生物过程条目1 372个，主要涉及调节细胞生长、细胞对激素刺激的反应等;分子功能条目104个，主要涉及转录因子结合、蛋白质结构域特异性结合等;细胞成分条目65个，主要涉及膜筏、膜微区等。共得139个KEGG富集条目，其中前20条信号通路依据KEGG BRITE层次分类，与疾病通路相关有16条，信号传导相关通路3条，1条与细胞过程相关通路。提示GLEXJ能通过多种疾病通路、信号通路及代谢通路对BMS发挥作用。 3 讨论
本研究应用网络药理学方法，从GLEXJ筛选出86个活性成分和647个潜在作用靶点，GLEXJ-BMS靶点达89个。通过分析“活性成分-靶点-疾病”调控网络，槲皮素、山萘酚、豆甾醇、β-谷甾醇等成分的靶点较多，推测是GLEXJ治疗BMS的主要成分。
在PPI网络中，发现核心靶蛋白为ESR1、RELA、EGFR、FOS、MAPK8、CCND1、NCOA2、NR3C1、APP、PRKCA，本研究发现GLEXJ作用于BMS的机制可大致分为2大类：①调控细胞周期与增殖方面，大剂量放化疗方案破坏骨髓基质细胞的细胞周期规律，如骨髓细胞的增殖和分化进程停滞或阻滞[4]，不能进入正常的细胞增殖，致使骨髓造血功能受阻。而细胞周期能否启动细胞增殖，关键的调控点在于G1与S期之间的调控点，CCND1是此调控点的细胞周期启动因子，路玫等[5]发现通过调控CCND1的表达，促进细胞由G1期-S期正常转化，能有效改善环磷酰胺化疗性BMS。与此同时，在富集分析中，GLEXJ成分与调节骨髓细胞分化、成骨、细胞生长调节等生物学过程，以及与骨髓细胞的分化、增殖周期等相关通路均能产生影响，从而影响造血功能。
②调控氧化应激方面：发生BMS的关键机制之一是HSCs衰老，而氧化损伤是细胞衰老的主流学说，HSCs自我更新与定向分化的平衡与抗氧化损伤有密切关系[6]。Sung等[7]发现通过调节MAPK通路，可缓解氧化应激，减缓BMS作用。
参考文献：
[1]牛素生，李楠，张燕，等.龟鹿二仙胶含药血清诱导大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的作用及机制[J].中国医药导报，2015，12（12）： 8-12+169.
[2]王珏，陈朝辉，邵科钉，等.龟鹿二仙胶逆转化疗诱导的造血干细胞衰老的机制研究[J].浙江中医药大学学报，2018，42（42）： 419-425.
[3]G David， G Aurélien， W Matthias， et al. SwissTargetPrediction： a web server for target prediction of bioactive small molecules[J]. 2014，42（42）：32-38.
[4]C J C r Sherr.The Pezcoller lecture： cancer cell cycles revisited[J].2000，60（60）：3689-3695.
[5]路玫，曹大明，赵喜新，等.针灸對环磷酰胺所致骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期调节蛋白Cyclin D1表达及细胞周期的动态影响[J].中国中西医结合杂志，2011，31（31）： 238-243.
[6]P Kirstetter， K Anderson， B T Porse， et al. Activation of the canonical Wnt pathway leads to loss of hematopoietic stem cell repopulation and multilineage differentiation block[J].2006，7（7）：1048-1056.
[7]S H Kim， I C Lee， J W Ko， et al. Diallyl Disulfide Prevents Cyclophosphamide-Induced Hemorrhagic Cystitis in Rats through the Inhibition of Oxidative Damage， MAPKs， and NF-κB Pathways[J].2015.