论文部分内容阅读
摘要：目的 建立快速测定黄蒲通窍胶囊中β-细辛醚含量的方法。方法 采用超高效液相色谱法。色谱柱为Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 ?m），流动相为水-乙腈（63∶37），流速0.35 mL/min，检测波长257 nm，柱温30 ℃。结果 β-细辛醚在0.034 3～0.171 5 ?g范围内与峰面积线性关系良好，r=0.999 9，平均加样回收率为98.53%，RSD=2.10%（n=6）。结论 所建立的方法快速、简便、易行，结果准确可靠，可作为黄蒲通窍胶囊的质量控制方法。
关键词：黄蒲通窍胶囊；β-细辛醚；超高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.019
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0048-03
黄蒲通窍胶囊为安徽中医学院第一附属医院院内制剂，是本院神经内科经长期临床实践总结的治疗血管性痴呆的口服胶囊制剂，具有益气补肾、豁痰化瘀功效，已在临床使用近20年[1-2]。黄蒲通窍胶囊处方由大黄、石菖蒲、何首乌等6味中药组成，其中大黄、石菖蒲为方中主药[3]。近年研究表明，石菖蒲所含成分中以β-细辛醚的含量较高，且β-细辛醚对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统等多个系统均有较强的药理活性[4]，提示β-细辛醚可能是黄蒲通窍胶囊治疗血管性痴呆的有效成分之一。本试验采用超高液相色谱法（UPLC）测定黄蒲通窍胶囊中β-细辛醚含量，为更好地控制该胶囊质量提供依据。
1 仪器与试药
Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色谱仪，包括四元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器以及Empower2数据处理工作站；AG285型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；电热套（南通市长江光学仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；真空干燥箱（上海博迅实业有限公司）；KQ3200DB型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。
β-细辛醚为实验室自制，经1H-NMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光谱检测确认其结构；按本方法色谱条件，归一化法测得其纯度为97.2%。黄蒲通窍处方饮片均由安徽中医学院第一附属医院中药库房提供，经鉴定为合格药材；黄蒲通窍胶囊为本课题组按照成熟工艺生产的样品（批号110801、110802、110803、110804、110805）；甲醇、乙腈均为色谱纯（美国Tedia公司）；水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 ?m）；流动相：水-乙腈（63∶37，V∶V）；波长检测：257 nm；柱温：30 ℃；流速：0.35 mL/min；进样量：1 ?L[5]。在上述色谱条件下β-细辛醚的分离度较好。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液制备
精密称取β-细辛醚对照品适量，配置成对照品母液，精密移取一定体积对照品制成浓度为β-细辛醚0.034 3 mg/mL的对照品溶液，过0.22 ?m微孔滤膜，即得。
2.3 供试品溶液的制备
精密称定胶囊内容物0.5 g左右，加入甲醇适量，超声20 min （功率150 W，频率40 Hz），放冷，过滤，加甲醇定容至10 mL量瓶中，摇匀，过0.22 ?m微孔滤膜，即得[5-6]。
2.4 阴性对照溶液制备
按照处方称取除石菖蒲外的各味药材，按供试品胶囊工艺方法制备阴性制剂，并按照“2.3”项下方法制备阴性对照溶液，备用。
2.5 标准曲线的制备
自动进样对照品溶液1、2、3、4、5 ?L，按“2.1”项下色谱条件测定，以色谱峰峰面积为纵坐标，以进样浓度为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，线性回归方程及相关系数为：Y=2.64×105X-1.50×104，r=0.999 9。结果表明，β-细辛醚在0.034 3～0.171 5 ?g范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
取β-细辛醚对照品溶液，自动重复进样6次，每次2 ?L，测得β-细辛醚峰面积RSD=0.75%（n=6）。结果表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验
取批号为110802供试品溶液，分别在第0、2、4、12、24 h，按“2.1”项下色谱条件测定，测得样品中β-细辛醚峰面积的RSD=1.03%（n=5），表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 重复性试验
取批号为110802供试品溶液，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定峰面积并计算β-细辛醚的含量，其RSD=0.28%（n=6）。
2.9 加样回收率试验
取已知β-细辛醚含量的批号为110802供试品溶液6份，分别加入β-细辛醚对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备并测定，计算得平均值为98.53%，RSD=2.10%（n=6），结果见表1。
2.10 样品含量测定
取5批黄浦通窍胶囊样品，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算样品中β-细辛醚含量。由表2测定结果可见，前2批样品中β-细辛醚含量要明显少于后3批，分析原因主要为制剂时前2批样品所用石菖蒲药材为同一批次，后3批样品为另一批次药材。实验结果与文献报道的不同产地、年限、采收季节石菖蒲的β-细辛醚含量差异明显的结果相一致[6]，也提示制剂生产前应对石菖蒲药材中的β-细辛醚进行含量控制以保证制剂的质量。 3 讨论
本课题组前期研究中已采用高效液相色谱法（HPLC）对方中的游离蒽醌总量进行了测定，作为质量控制指标[7]。对于中药复方制剂，如只以单一药物和单一指标成分进行质量控制，不能全面反映制剂的质量。本试验采用UPLC，对制剂中另一主药石菖蒲中的β-细辛醚含量进行测定方法研究，结果对进一步控制该制剂的质量具有一定的实际意义。UPLC具有分析时间短、分离效率高、重复性好、准确简便等优点。据相关文献报道，考察了加热回流提取采用HPLC测定β-细辛醚成分，通常需要测定25 min左右[5]，而本试验采用UPLC用时5 min左右即可完成一次进样，大幅提高了分析速度和效率。
在已有文献报道的基础上[5-6]，试验中分别考察了不同提取溶剂（乙醇、甲醇）和不同的提取方法（回流、超声）对β-细辛醚提取率的影响，结果表明，甲醇超声和回流提取同比较乙醇提取率稍高，其中甲醇超声0.5 h方法操作简单，故采用此方法。通过对Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 ?m）、Acquity BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 ?m）和Acquity HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 ?m）3种不同色谱柱的考察，结果证明Acquity BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 ?m）色谱柱对于所测的目标成分，分离度、峰型均较好，无干扰，故选用该型号色谱柱。试验考察了甲醇-水、乙腈-水等不同流动相的洗脱条件。结果发现，流动相为水-乙腈（37∶63，V∶V）对于所测目标分离度、峰型均较好，无干扰，故选用该流动相；同时也考察了柱温以及流速，最 终优化得到本试验色谱条件。本试验所建立的方法快捷、准确，重复性好，灵敏度高，可用于黄蒲通窍胶囊的质量控制。
参考文献：
[1] 陈永华，江停战，张波，等.黄蒲通窍胶囊治疗血管性痴呆的临床观察[J].中西医结合心脑血管病杂志，2010，8（1）：41-43.
[2] 胡玲玲，蔡标，马克龙，等.黄蒲通窍胶囊对血管性痴呆大鼠保护作用的实验研究[J].中国中医药科技，2008，15（6）：422-423.
[3] 汪远金，马克龙，那莎，等.黄蒲通窍胶囊对血管性痴呆大鼠SOD、MDA、AchE的影响[J].中国中医药科技，2005，12（5）：301-302.
[4] 刘晓鸿，张明生.β-细辛醚的药代及药理作用研究进展[J].医学理论与实践，2009，22（5）：542-544.
[5] 董玉，石任兵，刘斌.石菖蒲有效部位中α-细辛醚、β-细辛醚的含量测定[J].北京中医药大学学报，2007，30（5）：340-342.
[6] 黎奕明，眭道顺.石菖蒲的薄层鉴别及β-细辛醚的含量测定[J].中药新药与临床药理，2009，20（6）：369-370.
[7] 韩燕全，洪燕，谢道俊，等.HPLC法同时测定黄蒲通窍胶囊中3种蒽醌类成分的总含量[J].云南中医中药杂志，2011，32（2）：56-58.
（收稿日期：2012-01-05，编辑：陈静）
关键词：黄蒲通窍胶囊；β-细辛醚；超高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.019
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0048-03
黄蒲通窍胶囊为安徽中医学院第一附属医院院内制剂，是本院神经内科经长期临床实践总结的治疗血管性痴呆的口服胶囊制剂，具有益气补肾、豁痰化瘀功效，已在临床使用近20年[1-2]。黄蒲通窍胶囊处方由大黄、石菖蒲、何首乌等6味中药组成，其中大黄、石菖蒲为方中主药[3]。近年研究表明，石菖蒲所含成分中以β-细辛醚的含量较高，且β-细辛醚对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统等多个系统均有较强的药理活性[4]，提示β-细辛醚可能是黄蒲通窍胶囊治疗血管性痴呆的有效成分之一。本试验采用超高液相色谱法（UPLC）测定黄蒲通窍胶囊中β-细辛醚含量，为更好地控制该胶囊质量提供依据。
1 仪器与试药
Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色谱仪，包括四元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器以及Empower2数据处理工作站；AG285型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；电热套（南通市长江光学仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；真空干燥箱（上海博迅实业有限公司）；KQ3200DB型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。
β-细辛醚为实验室自制，经1H-NMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光谱检测确认其结构；按本方法色谱条件，归一化法测得其纯度为97.2%。黄蒲通窍处方饮片均由安徽中医学院第一附属医院中药库房提供，经鉴定为合格药材；黄蒲通窍胶囊为本课题组按照成熟工艺生产的样品（批号110801、110802、110803、110804、110805）；甲醇、乙腈均为色谱纯（美国Tedia公司）；水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 ?m）；流动相：水-乙腈（63∶37，V∶V）；波长检测：257 nm；柱温：30 ℃；流速：0.35 mL/min；进样量：1 ?L[5]。在上述色谱条件下β-细辛醚的分离度较好。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液制备
精密称取β-细辛醚对照品适量，配置成对照品母液，精密移取一定体积对照品制成浓度为β-细辛醚0.034 3 mg/mL的对照品溶液，过0.22 ?m微孔滤膜，即得。
2.3 供试品溶液的制备
精密称定胶囊内容物0.5 g左右，加入甲醇适量，超声20 min （功率150 W，频率40 Hz），放冷，过滤，加甲醇定容至10 mL量瓶中，摇匀，过0.22 ?m微孔滤膜，即得[5-6]。
2.4 阴性对照溶液制备
按照处方称取除石菖蒲外的各味药材，按供试品胶囊工艺方法制备阴性制剂，并按照“2.3”项下方法制备阴性对照溶液，备用。
2.5 标准曲线的制备
自动进样对照品溶液1、2、3、4、5 ?L，按“2.1”项下色谱条件测定，以色谱峰峰面积为纵坐标，以进样浓度为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，线性回归方程及相关系数为：Y=2.64×105X-1.50×104，r=0.999 9。结果表明，β-细辛醚在0.034 3～0.171 5 ?g范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
取β-细辛醚对照品溶液，自动重复进样6次，每次2 ?L，测得β-细辛醚峰面积RSD=0.75%（n=6）。结果表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验
取批号为110802供试品溶液，分别在第0、2、4、12、24 h，按“2.1”项下色谱条件测定，测得样品中β-细辛醚峰面积的RSD=1.03%（n=5），表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 重复性试验
取批号为110802供试品溶液，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定峰面积并计算β-细辛醚的含量，其RSD=0.28%（n=6）。
2.9 加样回收率试验
取已知β-细辛醚含量的批号为110802供试品溶液6份，分别加入β-细辛醚对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备并测定，计算得平均值为98.53%，RSD=2.10%（n=6），结果见表1。
2.10 样品含量测定
取5批黄浦通窍胶囊样品，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算样品中β-细辛醚含量。由表2测定结果可见，前2批样品中β-细辛醚含量要明显少于后3批，分析原因主要为制剂时前2批样品所用石菖蒲药材为同一批次，后3批样品为另一批次药材。实验结果与文献报道的不同产地、年限、采收季节石菖蒲的β-细辛醚含量差异明显的结果相一致[6]，也提示制剂生产前应对石菖蒲药材中的β-细辛醚进行含量控制以保证制剂的质量。 3 讨论
本课题组前期研究中已采用高效液相色谱法（HPLC）对方中的游离蒽醌总量进行了测定，作为质量控制指标[7]。对于中药复方制剂，如只以单一药物和单一指标成分进行质量控制，不能全面反映制剂的质量。本试验采用UPLC，对制剂中另一主药石菖蒲中的β-细辛醚含量进行测定方法研究，结果对进一步控制该制剂的质量具有一定的实际意义。UPLC具有分析时间短、分离效率高、重复性好、准确简便等优点。据相关文献报道，考察了加热回流提取采用HPLC测定β-细辛醚成分，通常需要测定25 min左右[5]，而本试验采用UPLC用时5 min左右即可完成一次进样，大幅提高了分析速度和效率。
在已有文献报道的基础上[5-6]，试验中分别考察了不同提取溶剂（乙醇、甲醇）和不同的提取方法（回流、超声）对β-细辛醚提取率的影响，结果表明，甲醇超声和回流提取同比较乙醇提取率稍高，其中甲醇超声0.5 h方法操作简单，故采用此方法。通过对Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 ?m）、Acquity BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 ?m）和Acquity HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 ?m）3种不同色谱柱的考察，结果证明Acquity BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 ?m）色谱柱对于所测的目标成分，分离度、峰型均较好，无干扰，故选用该型号色谱柱。试验考察了甲醇-水、乙腈-水等不同流动相的洗脱条件。结果发现，流动相为水-乙腈（37∶63，V∶V）对于所测目标分离度、峰型均较好，无干扰，故选用该流动相；同时也考察了柱温以及流速，最 终优化得到本试验色谱条件。本试验所建立的方法快捷、准确，重复性好，灵敏度高，可用于黄蒲通窍胶囊的质量控制。
参考文献：
[1] 陈永华，江停战，张波，等.黄蒲通窍胶囊治疗血管性痴呆的临床观察[J].中西医结合心脑血管病杂志，2010，8（1）：41-43.
[2] 胡玲玲，蔡标，马克龙，等.黄蒲通窍胶囊对血管性痴呆大鼠保护作用的实验研究[J].中国中医药科技，2008，15（6）：422-423.
[3] 汪远金，马克龙，那莎，等.黄蒲通窍胶囊对血管性痴呆大鼠SOD、MDA、AchE的影响[J].中国中医药科技，2005，12（5）：301-302.
[4] 刘晓鸿，张明生.β-细辛醚的药代及药理作用研究进展[J].医学理论与实践，2009，22（5）：542-544.
[5] 董玉，石任兵，刘斌.石菖蒲有效部位中α-细辛醚、β-细辛醚的含量测定[J].北京中医药大学学报，2007，30（5）：340-342.
[6] 黎奕明，眭道顺.石菖蒲的薄层鉴别及β-细辛醚的含量测定[J].中药新药与临床药理，2009，20（6）：369-370.
[7] 韩燕全，洪燕，谢道俊，等.HPLC法同时测定黄蒲通窍胶囊中3种蒽醌类成分的总含量[J].云南中医中药杂志，2011，32（2）：56-58.
（收稿日期：2012-01-05，编辑：陈静）