【摘 要】
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本文研究了将嗜碱顶孢霉中的GH25溶菌酶基因进行密码子优化后，构建包含糖化酶信号肽的溶菌酶单拷贝和双拷贝表达载体并均由启动子PnaⅡ控制表达，利用双拷贝表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑工具，使用PEG介导法转化无孢黑曲霉宿主HL-1，获得高酶活力的溶菌酶表达菌株。重组菌株LyAa-C的溶菌酶活力达到2291.37U/mL，是仅使用双拷贝表达载体的LyAa-F菌株酶活力（869.74U/mL
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2021YFC2100200）；
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本文研究了将嗜碱顶孢霉中的GH25溶菌酶基因进行密码子优化后，构建包含糖化酶信号肽的溶菌酶单拷贝和双拷贝表达载体并均由启动子PnaⅡ控制表达，利用双拷贝表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑工具，使用PEG介导法转化无孢黑曲霉宿主HL-1，获得高酶活力的溶菌酶表达菌株。重组菌株LyAa-C的溶菌酶活力达到2291.37U/mL，是仅使用双拷贝表达载体的LyAa-F菌株酶活力（869.74U/mL）的2.63倍，是仅使用传统单拷贝表达载体的LyAa-T菌株酶活力（358.41U/mL）的6.39倍。通过6×His标签使用镍柱亲和层析成功纯化了重组溶菌酶LyAa，并对其酶学性质进行了分析。溶菌酶LyAa蛋白大小约为25.0ku，最适pH值为4.0，最适温度为30℃，并显示出良好的胃蛋白酶稳定性。综上，本文基于双拷贝载体和CRISPR技术成功优化和提高了溶菌酶在黑曲霉中的表达。
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