探讨树突状表皮T淋巴细胞(DETC)和Vγ4 T淋巴细胞对小鼠表皮细胞增殖分化的影响及其在创面愈合中的作用。
方法(1)取6只8周龄C57BL/6雄性小鼠，采用随机数字表法(分组方法下同)分为对照组和创面组，每组3只。于创面组小鼠背部剪1条长4 cm深达皮肤全层的直线切口，对照组小鼠不行任何处理。伤后3 d，断颈处死2组小鼠，取创面组小鼠背部距创缘5 mm内的皮肤，取对照组小鼠相应部位正常皮肤制成单细胞悬液，流式细胞仪检测表达白细胞介素17A(IL－17A)的Vγ4 T淋巴细胞的百分比及表达胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF－Ⅰ)的DETC百分比。(2)取10只8周龄C57BL/6雄性小鼠，分为对照组和Vγ4 T淋巴细胞清除组，每组5只。Vγ4 T淋巴细胞清除组小鼠腹腔注射200 g亚美尼亚仓鼠抗小鼠Vγ4 T淋巴细胞单克隆中和抗体，对照组小鼠腹腔注射等量亚美尼亚仓鼠Ig，分别于背部脊柱两侧各打1个深达皮肤全层的孔，观察伤后1～8 d创面愈合情况，并计算剩余创面面积百分比。(3)取6只8周龄C57BL/6雄性小鼠，同实验(2)进行分组及处理，每组3只。伤后3 d，蛋白质印迹法检测创缘表皮组织IL－17A和IGF－Ⅰ的蛋白表达。(4)取30只3 d龄C57BL/6雄性小鼠，断颈处死后提取表皮细胞，流式细胞仪(下同)检测角蛋白14阳性细胞率。(5)另取小鼠表皮细胞，分为对照组、IGF－Ⅰ组与IL－17A组，每组3孔(下同)。IGF－Ⅰ组与IL－17A组细胞分别加入1 mL终质量浓度为100 ng/mL的重组小鼠IGF－Ⅰ和重组小鼠IL－17A，对照组细胞加入等量无菌磷酸盐缓冲液(PBS)。培养5 d后，检测角蛋白14阴性细胞率。另取小鼠表皮细胞，同前进行分组及处理，培养10 d后，检测角蛋白10阳性细胞率。(6)另取小鼠表皮细胞，加入4 mmol/L羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)染液，分为对照0 d组、对照7 d组、IGF－Ⅰ组、IL－17A组。IGF－Ⅰ组、IL－17A组细胞同实验(5)对应组进行处理，对照0 d组、对照7 d组细胞同实验(5)对照组进行处理。对照0 d组细胞培养0 d，余3组细胞培养7 d，检测CFSE荧光波峰位置。(7)另取小鼠表皮细胞，分为对照组、IGF－Ⅰ组。IGF－Ⅰ组细胞加入1 mL终质量浓度为100 ng/mL重组小鼠IGF－Ⅰ，对照组细胞加入等量无菌PBS，培养5 d后，同前进行角蛋白14和CFSE染色，检测CFSE阳性细胞角蛋白14阴性细胞率。另取小鼠表皮细胞，分为对照组与IL－17A组，IL－17A组细胞加入1 mL终质量浓度为100 ng/mL重组小鼠IL－17A，对照组细胞加入等量无菌PBS，培养5 d后，检测CFSE阳性细胞角蛋白14阴性细胞率。对数据行单因素方差分析和t检验。
结果(1)伤后3 d，对照组小鼠正常表皮组织中表达IGF－Ⅰ的DETC百分比为(9.9±0.8)%，明显低于创面组小鼠创缘表皮组织中的(19.0±0.6)%，t＝8.70，P<0.01；对照组小鼠正常表皮组织中表达IL－17A的Vγ4 T淋巴细胞百分比为(0.123±0.024)%，明显低于创面组小鼠创缘表皮组织中的(8.967±0.406)%，t＝21.77，P<0.01。(2)对照组小鼠伤后1～4 d创面周围有明显的炎症反应；伤后5～8 d，创面面积仍较大。Vγ4 T淋巴细胞清除组小鼠伤后1～4 d创面周围炎症反应较轻；伤后5～8 d，创面面积明显缩小。伤后3～7 d，Vγ4 T淋巴细胞清除组小鼠剩余创面面积百分比明显低于对照组(t＝5.92、5.74、7.17、5.38、5.57，P<0.01)；培养1、2、8 d，2组小鼠剩余创面面积百分比相近(t＝1.46、3.17、3.10，P>0.05)。(3)伤后3 d，与对照组比较，Vγ4 T淋巴细胞清除组小鼠创缘表皮组织的IL－17A蛋白表达明显下降，IGF－Ⅰ蛋白表达明显升高(t＝8.47、19.24，P<0.01)。(4)小鼠表皮细胞角蛋白14阳性细胞率为94.7%。(5)培养5 d后，对照组小鼠表皮细胞角蛋白14阴性细胞率明显高于IGF－Ⅰ组，明显低于IL－17A组(t＝7.25、5.64，P<0.01)。培养10 d后，对照组小鼠表皮细胞角蛋白10阳性细胞率明显高于IGF－Ⅰ组，明显低于IL－17A组(t＝3.99、10.82，P<0.05或P<0.01)。(6)相较于对照0 d组，对照7 d组、IGF－Ⅰ组和IL－17A组小鼠表皮细胞培养7 d后CFSE荧光波峰左移。相较于对照7 d组，IGF－Ⅰ组和IL－17A组小鼠表皮细胞培养7 d后CFSE荧光波峰均左移。(7)培养5 d后，对照组CFSE阳性小鼠表皮细胞角蛋白14阴性细胞率明显高于IGF－Ⅰ组(t＝9.91，P<0.01)，对照组CFSE阳性小鼠表皮细胞角蛋白14阴性细胞率明显低于IL－17A组(t＝6.49，P<0.01)。
结论在创面愈合过程中，DETC分泌的IGF－Ⅰ促进小鼠角蛋白14阳性表皮细胞增殖并抑制其终末分化，Vγ4 T淋巴细胞分泌的IL－17A促进其增殖及终末分化，从而影响创面愈合。