构建婆娑双树基因SALL4的特异性干扰载体并转染儿童睾丸卵黄囊瘤细胞,评价干扰效果,为研究SALL4基因功能提供实验工具。
方法针对不同干扰位点,设计4条特异性siRNA和1条阴性对照序列。构建SALL4干扰质粒载体pGPU6/GFP/Neo-SALL4 shRNA,分空白对照组(Blank组)、阴性对照组(NC组)、单加转染试剂组(MOCK组)、干扰组(SALL4-homo-483、SALL4-homo-1874、SALL4-homo-951、SALL4-homo-3110),分别转染体外培养的儿童睾丸卵黄囊瘤细胞,采用荧光定量PCR和Western bolt技术比较各组细胞SALL4基因mRNA及蛋白表达情况,筛选出最佳干扰序列。
结果荧光定量PCR结果显示,Blank组、NC组、MOCK组、干扰组(SALL4-homo-483、SALL4-homo-951、SALL4-homo-1874、SALL4-homo-3110)SALL4基因mRNA的表达水平分别为100%、(118.0±18.0)%、(128.0±15.0)%、(91.0±21.0)%、(25.0±8.0)%、(59.0±11.0)%、(49.0±13.0)%。SALL4-homo-951、SALL4-homo-3110相比Blank组、NC组、MOCK组mRNA表达下降,差异有统计学意义(F=3.63,P<0.05)。Western bolt的检测结果显示Blank组、NC组、MOCK组、干扰组(SALL4-homo-483、SALL4-homo-951、SALL4-homo-1874、SALL4-homo-3110)SALL4基因蛋白表达水平分别为1、1.1±0.1、1.3±0.3、1.7±0.4、0.2±0.1、0.9±0.2和0.4±0.1。相对Blank组、NC组、MOCK组,SALL4干扰组中SALL4-homo-951、SALL4-homo-3110均能降低蛋白表达,其中SALL4-homo-951降低最多,差异有统计学意义(F=7.96,P<0.05)。
结论SALL4-homo-951、SALL4-homo-3110均能有效干扰SALL4基因在儿童卵黄囊瘤中的表达,其中SALL4-homo-951干扰效果最佳,可用于下一步实验研究。