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目的 建立pRevX-GFP及其作对照的表达野生X蛋白、绿色荧光蛋白的长期稳定表达细胞克隆,进一步研究以乙型肝炎病毒(HBV)X基因作为治疗靶,运用DN突变体技术,进行抗HBV的稳定表达对抗HBV复制的作用. 方法运用基因工程技术,分别以逆转录病毒载体pRev TRE为载体,构建表达野生型HBV X蛋白,GFP蛋白和X与GFP融合的X-GFP融合蛋白的质粒,并分别导入乙型肝炎的转基因细胞株HepG2 2.2.15细胞(简称2.2.15细胞)中,并通过长期的潮霉素抗性选择,获得能稳定表达DN蛋白的2.2.15细胞克隆.应用dot blot检测细胞上清液及细胞中HBV DNA,Southern blot检测细胞内HBV复制中间体,以观察其表达对HBV病毒复制的影响. 结果所构建的pRevX-GFP突变体、pRev Xwt、pRev GFP质粒均能在2.2.15细胞株中稳定高效表达.pRevX-GFP高效表达后,能有效地抑制或阻断细胞内HBV核酸合成及其分泌入细胞上清液.定量聚合酶链反应结果显示,pRevX-GFP组的平均每毫升HBV DNA浓度较2.2.15细胞组分别下降1.0～1.8lg值,对细胞内外dot blot结果进行图像分析,其灰度值仅为对照2.2.15细胞组的7.9%,Southern blot分析则发现,X基因DN突变体对HBV复制中间体rcDNA、ssDNA及dsDNA的形成有全面抑制作用. 结论 pRevX-GFP DN突变体具有显著抑制HBV复制作用.初步证实X基因是HBV治疗的一个新靶点.针对X基因的治疗,有望为HBV治疗提供一些新的思路。