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【摘要】 目的研究体外传代培养对人类视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelialium，HRPE）细胞免疫活性的影响。方法采用流式细胞术检测原代及传代HRPE细胞（第1、2、3、4、5、6代）表面HLA-ABC、HLA-DR和ICAM-1表达的变化。结果 HRPE细胞基础性表达HLA-ABC，低表达HLA-DR和ICAM-1；体外传代培养时HRPE细胞HLA-ABC表达下调，表达量与传代代数呈负相关(阳性细胞率：r = -0.924，P<0.001；平均荧光强度： r = -0.820，P<0.001)；体外传代培养时HRPE细胞ICAM-1表达上调，表达量与传代代数呈正相关(阳性细胞率： r =0.914，P<0.001；平均荧光强度： r =0.828，P<0.001)。结论HRPE细胞移植排斥反应主要是慢性排斥反应；应用体外传代培养HRPE细胞移植时可降低急性排斥反应的发生率，但增高慢性排斥反应的发生率。
【关键词】 人类视网膜色素上皮细胞；传代培养；免疫活性
近年来研究表明移植的人类视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelialium，HRPE）细胞可拯救变性的感光细胞，有望为治疗视网膜色素上皮细胞变性等疾病提供一新的治疗途径[1]。体外传代培养获取大量的HRPE细胞是进行研究和移植的首要条件。目前有关体外培养对HRPE免疫活性影响的报道极少，本文研究体外传代培养时HRPE免疫活性的变化规律，为探讨HRPE体外培养条件，减弱HRPE移植免疫排斥和诱导HRPE移植免疫赦免奠定实验基础。
1 材料和方法
1. 1主要仪器美国Forma CO2培养箱、苏州超净工作台、日本OLYMPUS倒置相差显微镜、Beckman-Coulter Epics XL 流式细胞仪、太仓HZ-8211K恒温振荡仪。
1. 2试剂DMEM/F12培养基、胎牛血清、小牛血清、0.25%胰蛋白酶（均为Gibco公司）、EDTA粉、PBS粉（Sigma公司），鼠抗人角蛋白质-18抗体（北京中杉公司），鼠抗人HLA-ABC单克隆荧光抗体（FITC标记）、鼠抗人HLA-DR单克隆荧光抗体（Pcy5标记）、鼠抗人ICAM-1单克隆荧光抗体（PE标记）（Coulter公司）。
1.3 HRPE细胞的取材和原代、传代培养及鉴定取角膜移植供体的健康成人眼球，用灭菌冰盒转移至超净工作台内，修剪球壁结缔组织，75%酒精润洗眼球两次，用含500IU/ml青霉素的PBS液冲洗干净，由角膜缘后3.5mm处环形剪开眼球壁，去除眼前节、玻璃体。将后段眼杯置于自制的眼球托上，不含血清的DMEM/F12培养液冲洗眼杯并用滴管反复吹打使眼球内壁表面菲薄的视网膜神经上皮层脱离，视乳头前网膜应去除干净，必要时可辅以显微镊剪除。加入0.25%胰蛋白酶后放入培养箱中静置消化10分钟。取出弃除其中液体，再加入0.25%胰蛋白酶后放入培养箱中静置消化30分钟。取出后加含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液（完全培养液）终止胰蛋白酶反应，并用滴管吹打眼球内壁，以使RPE细胞脱落分散。将含RPE细胞的液体移入离心管中，1000r/min离心10分钟，弃上清。加入少许0.25%胰蛋白酶再次消化，吹打约5分钟后再加入完全培养液终止消化。再次离心弃上清后加入完全培养液将RPE细胞悬浮并以2.0×105接种于25cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。3天后开始换液，采用半量换液法，每2天换液1次，当细胞增殖到单层融合时(约80%)按1：3传代。细胞鉴定采用角蛋白18免疫组化SP法进行鉴定。
1.4体外传代培养对HRPE免疫活性的影响HRPE免疫活性采用流式细胞仪检测HRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、ICAM-1的表达。实验分对照组：原代HRPE细胞（P0）；第1代HRPE细胞组（P1）、第2代HRPE细胞组（P2）、第3代HRPE细胞组（P3）、第4代HRPE细胞组（P4）、第5代HRPE细胞组（P5）、第6代HRPE细胞组（P6）。检测时吸除瓶内旧培养液， PBS液润洗培养瓶后再加5ml0.04%的EDTA的PBS液进行消化（37℃ 30min，至贴壁细胞间出筛状间隙为止），用细胞刮将细胞自瓶壁上轻轻刮下吹散并移入离心管，短时低速离心，弃上清，加10%鼠血清PBS液（封闭非特异性结合位点）1ml吹打5min后静置30min，并短时低速离心，弃上清，加PBS液3ml将细胞吹打均匀，用300目尼龙网过滤成单细胞，短时低速离心，加标记的抗体在恒温振荡仪（26℃，80 r/min）上染色30min，短时低速离心，弃上清加入0.4mlPBS上机测定。测量其阳性细胞率和平均荧光强度，结果以X±SD表示。
1.5统计学处理
统计数据采用SPSS11.0统计软件处理，以P<0.05作为差别有统计学意义的检验标准。结果数据采用Kendall's相关分析并对相关系数进行假设检验。
2、结果
2.1角蛋白18免疫组化SP法细胞鉴定细胞爬片进行角蛋白18免疫组化染色阳性细胞率为100%。
2.2体外传代培养对HRPE免疫活性的影响采用流式细胞仪检测体外传代培养时HRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、ICAM-1的阳性细胞率变化如图1所示；平均荧光强度见表1。检测结果见图2。正常HRPE细胞基础性表达HLA-ABC，低表达HLA-DR及ICAM-1。体外传代培养时HRPE细胞HLA-ABC表达下调，表达量与传代代数呈负相关(阳性细胞率：相关系数r=0.924，P<0.001；平均荧光强度：相关系数r=-0.820，P<0.001)；体外传代培养时HRPE细胞ICAM-1表达上调，表达量与传代代数呈正相关(阳性细胞率：相关系数r=0.914，P<0.001；平均荧光强度：相关系数r=-0.820，P<0.001)；体外传代培养后HRPE细胞HLA-DR表达无明显变化（阳性细胞率：相关系数r=0.106，P=0.356；平均荧光强度：相关系数r=-0.007，P=0.948)。
3、讨论
随着人类寿命普遍的延长,人群中主要致盲眼病正逐渐由白内障向老年性黄斑变性及视网膜色素上皮细胞变性等疾病演变。近年研究表明移植的人类视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelialium，HRPE）细胞可拯救变性的感光细胞，可望将来成为治疗老年性黄斑变性、视网膜色素上皮细胞变性等疾病的一种新技术。体外传代培养获取大量的HRPE细胞是进行研究和移植的首要条件。
尽管视网膜下腔被认为是相对的免疫赦免区，但体内HRPE具有弱的免疫原性，一旦发生免疫排斥反应，不仅影响移植细胞在视网膜下腔的长期存活，而且会导致移植区出血、血-视网膜屏障破坏、视网膜水肿等一系列问题[ 1 ]。因此，有必要研究体外传代培养对HRPE细胞免疫活性的影响。
每个人的免疫特异性主要由个体的主要组织相容性复合物（MHC）基因所决定。HLA抗原是人类的主要组织相容性抗原，早期被称为移植抗原，在免疫系统调节和组织器官移植免疫排斥中起重要作用。在移植免疫排斥中以HLA-DR最为重要，其次是HLA-DP、HLA-DQ和HLA-ABC。
与组织器官移植免疫排斥反应一样，RPE移植的免疫排斥始于宿主T淋巴细胞对移植物表面移植抗原的识别。这个识别过程需要抗原提呈细胞通过合适的刺激信号和共剌激信号经细胞因子信号传递途径将异体抗原提呈给T细胞。然而对于RPE移植，移植的是单一细胞到无血管的视网膜下腔，与其他移植不同的是缺乏供体抗原提呈细胞，此时不可能有供体抗原提呈细胞进行抗原提呈。此时有两种途径可引起宿主T细胞识别异体抗原。第一种途径是由RPE细胞自身做为抗原提呈细胞而不需宿主抗原提呈细胞，这为直接途径。另一种途径是通过宿主抗原提呈细胞（如脉络膜树突状细胞、巨噬细胞和视网膜小胶质细胞）呈递RPE细胞的MHC分子，此为间接途径。直接途径中T细胞识别MHCⅡ分子阳性的细胞，这在早期移植排斥反应中起主要作用。间接途径中T细胞识别由抗原提呈细胞提呈的同种异体MHCⅡ分子而在慢性移植排斥反应中起重要作用。研究发现正常HRPE细胞基础性表达HLA-ABC，低表达HLA-DR及ICAM-1〔２，３〕。因此，RPE细胞移植排斥反应主要是慢性排斥反应。
T细胞的激活需要两种信号：第一信号主要来自T细胞的TCR与MHC分子-抗原复合物的特异性结合，CD4和CD8分子作为共受体分别与MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ类分子结合，增强T细胞与抗原提呈细胞间的粘附作用，参与第一信号的启动和转导；第二信号又称协同剌激信号，主要由T细胞和抗原提呈细胞表面粘附分子对的相互作用提供，最重要的是T细胞表面CD28分子与抗原提呈细胞表面相应配体B7-1（CD80）和B7-2（CD86）的结合。此外抗原提呈细胞细胞表达的其他协同剌激分子还包括VCAM-1、ICAM-1和LFA-3，它们分别与T细胞表面的VLA-4、LFA-1和CD2分子结合，共同提供T细胞活化的第二信号〔４-６〕。
研究发现体外传代培养时HRPE细胞HLA-ABC表达下调，表达量与传代代数呈负相关；体外传代培养时HRPE细胞ICAM-1表达上调，表达量与传代代数呈正相关；体外传代培养后HRPE细胞HLA-DR表达无明显变化。所以应用体外传代培养HRPE细胞进行移植时，由于HRPE细胞HLA-ABC表达下调，抗原性下降，可降低急性排斥反应的发生率。但由于ICAM-1表达增高，一方面可促使宿主白细胞迁移至视网膜下腔作为抗原提呈细胞，另一方面可增加T细胞激活的协同剌激信号，从而促进慢性排斥反应的发生。
参考文献
〔1〕Enzmann V, F Faude, P Wiedemann et al. Immunological problems of transplantation into the subretinal space[M]. Acta Anat (Basel), Jan 1998; 162(2-3): 178-83
〔2〕Sun D, Enzmann V, Lei S et al. Retinal pigment epithelial cells activate uveitogenic T cells when they express high levels of MHC class II molecules, but inhibit T cell activation when they express restricted levels[J]. J Neuroimmunol. 2003 Nov;144(1-2):1-8.
〔3〕Enzmann V, Hollborn M, Wiedemann P et al. Molecular and cellular evidence for T-cell stimulation by allogeneic retinal pigment epithelium cells in vitro[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2001 Jul;239(6):445-51.
〔4〕Enzmann V, Stadler M, Wiedemann P et al. In-vitro methods to decrease MHC class II-positive cells in retinal pigment epithelium cell grafts[J]. Ocul Immunol Inflamm. 1998 Sep;6(3):145-53.
〔5〕L Farrokh-Siar, KA Rezai, RT Semnani, SC Patel, JT Ernest, and GA van Seventer
Human fetal retinal pigment epithelium suppresses the activation of CD4(+) and CD8(+) T-cells[J].
Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, Nov 1999; 237(11): 934-9.
〔6〕L Farrokh-Siar, KA Rezai, EM Palmer et al. Cytokine modulation of costimulatory molecules on human fetal retinal pigment epithelial cells[J]. Curr Eye Res, Oct 2001; 23(4): 285-90.
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”
【关键词】 人类视网膜色素上皮细胞；传代培养；免疫活性
近年来研究表明移植的人类视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelialium，HRPE）细胞可拯救变性的感光细胞，有望为治疗视网膜色素上皮细胞变性等疾病提供一新的治疗途径[1]。体外传代培养获取大量的HRPE细胞是进行研究和移植的首要条件。目前有关体外培养对HRPE免疫活性影响的报道极少，本文研究体外传代培养时HRPE免疫活性的变化规律，为探讨HRPE体外培养条件，减弱HRPE移植免疫排斥和诱导HRPE移植免疫赦免奠定实验基础。
1 材料和方法
1. 1主要仪器美国Forma CO2培养箱、苏州超净工作台、日本OLYMPUS倒置相差显微镜、Beckman-Coulter Epics XL 流式细胞仪、太仓HZ-8211K恒温振荡仪。
1. 2试剂DMEM/F12培养基、胎牛血清、小牛血清、0.25%胰蛋白酶（均为Gibco公司）、EDTA粉、PBS粉（Sigma公司），鼠抗人角蛋白质-18抗体（北京中杉公司），鼠抗人HLA-ABC单克隆荧光抗体（FITC标记）、鼠抗人HLA-DR单克隆荧光抗体（Pcy5标记）、鼠抗人ICAM-1单克隆荧光抗体（PE标记）（Coulter公司）。
1.3 HRPE细胞的取材和原代、传代培养及鉴定取角膜移植供体的健康成人眼球，用灭菌冰盒转移至超净工作台内，修剪球壁结缔组织，75%酒精润洗眼球两次，用含500IU/ml青霉素的PBS液冲洗干净，由角膜缘后3.5mm处环形剪开眼球壁，去除眼前节、玻璃体。将后段眼杯置于自制的眼球托上，不含血清的DMEM/F12培养液冲洗眼杯并用滴管反复吹打使眼球内壁表面菲薄的视网膜神经上皮层脱离，视乳头前网膜应去除干净，必要时可辅以显微镊剪除。加入0.25%胰蛋白酶后放入培养箱中静置消化10分钟。取出弃除其中液体，再加入0.25%胰蛋白酶后放入培养箱中静置消化30分钟。取出后加含15%胎牛血清的DMEM/F12培养液（完全培养液）终止胰蛋白酶反应，并用滴管吹打眼球内壁，以使RPE细胞脱落分散。将含RPE细胞的液体移入离心管中，1000r/min离心10分钟，弃上清。加入少许0.25%胰蛋白酶再次消化，吹打约5分钟后再加入完全培养液终止消化。再次离心弃上清后加入完全培养液将RPE细胞悬浮并以2.0×105接种于25cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。3天后开始换液，采用半量换液法，每2天换液1次，当细胞增殖到单层融合时(约80%)按1：3传代。细胞鉴定采用角蛋白18免疫组化SP法进行鉴定。
1.4体外传代培养对HRPE免疫活性的影响HRPE免疫活性采用流式细胞仪检测HRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、ICAM-1的表达。实验分对照组：原代HRPE细胞（P0）；第1代HRPE细胞组（P1）、第2代HRPE细胞组（P2）、第3代HRPE细胞组（P3）、第4代HRPE细胞组（P4）、第5代HRPE细胞组（P5）、第6代HRPE细胞组（P6）。检测时吸除瓶内旧培养液， PBS液润洗培养瓶后再加5ml0.04%的EDTA的PBS液进行消化（37℃ 30min，至贴壁细胞间出筛状间隙为止），用细胞刮将细胞自瓶壁上轻轻刮下吹散并移入离心管，短时低速离心，弃上清，加10%鼠血清PBS液（封闭非特异性结合位点）1ml吹打5min后静置30min，并短时低速离心，弃上清，加PBS液3ml将细胞吹打均匀，用300目尼龙网过滤成单细胞，短时低速离心，加标记的抗体在恒温振荡仪（26℃，80 r/min）上染色30min，短时低速离心，弃上清加入0.4mlPBS上机测定。测量其阳性细胞率和平均荧光强度，结果以X±SD表示。
1.5统计学处理
统计数据采用SPSS11.0统计软件处理，以P<0.05作为差别有统计学意义的检验标准。结果数据采用Kendall's相关分析并对相关系数进行假设检验。
2、结果
2.1角蛋白18免疫组化SP法细胞鉴定细胞爬片进行角蛋白18免疫组化染色阳性细胞率为100%。
2.2体外传代培养对HRPE免疫活性的影响采用流式细胞仪检测体外传代培养时HRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、ICAM-1的阳性细胞率变化如图1所示；平均荧光强度见表1。检测结果见图2。正常HRPE细胞基础性表达HLA-ABC，低表达HLA-DR及ICAM-1。体外传代培养时HRPE细胞HLA-ABC表达下调，表达量与传代代数呈负相关(阳性细胞率：相关系数r=0.924，P<0.001；平均荧光强度：相关系数r=-0.820，P<0.001)；体外传代培养时HRPE细胞ICAM-1表达上调，表达量与传代代数呈正相关(阳性细胞率：相关系数r=0.914，P<0.001；平均荧光强度：相关系数r=-0.820，P<0.001)；体外传代培养后HRPE细胞HLA-DR表达无明显变化（阳性细胞率：相关系数r=0.106，P=0.356；平均荧光强度：相关系数r=-0.007，P=0.948)。
3、讨论
随着人类寿命普遍的延长,人群中主要致盲眼病正逐渐由白内障向老年性黄斑变性及视网膜色素上皮细胞变性等疾病演变。近年研究表明移植的人类视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelialium，HRPE）细胞可拯救变性的感光细胞，可望将来成为治疗老年性黄斑变性、视网膜色素上皮细胞变性等疾病的一种新技术。体外传代培养获取大量的HRPE细胞是进行研究和移植的首要条件。
尽管视网膜下腔被认为是相对的免疫赦免区，但体内HRPE具有弱的免疫原性，一旦发生免疫排斥反应，不仅影响移植细胞在视网膜下腔的长期存活，而且会导致移植区出血、血-视网膜屏障破坏、视网膜水肿等一系列问题[ 1 ]。因此，有必要研究体外传代培养对HRPE细胞免疫活性的影响。
每个人的免疫特异性主要由个体的主要组织相容性复合物（MHC）基因所决定。HLA抗原是人类的主要组织相容性抗原，早期被称为移植抗原，在免疫系统调节和组织器官移植免疫排斥中起重要作用。在移植免疫排斥中以HLA-DR最为重要，其次是HLA-DP、HLA-DQ和HLA-ABC。
与组织器官移植免疫排斥反应一样，RPE移植的免疫排斥始于宿主T淋巴细胞对移植物表面移植抗原的识别。这个识别过程需要抗原提呈细胞通过合适的刺激信号和共剌激信号经细胞因子信号传递途径将异体抗原提呈给T细胞。然而对于RPE移植，移植的是单一细胞到无血管的视网膜下腔，与其他移植不同的是缺乏供体抗原提呈细胞，此时不可能有供体抗原提呈细胞进行抗原提呈。此时有两种途径可引起宿主T细胞识别异体抗原。第一种途径是由RPE细胞自身做为抗原提呈细胞而不需宿主抗原提呈细胞，这为直接途径。另一种途径是通过宿主抗原提呈细胞（如脉络膜树突状细胞、巨噬细胞和视网膜小胶质细胞）呈递RPE细胞的MHC分子，此为间接途径。直接途径中T细胞识别MHCⅡ分子阳性的细胞，这在早期移植排斥反应中起主要作用。间接途径中T细胞识别由抗原提呈细胞提呈的同种异体MHCⅡ分子而在慢性移植排斥反应中起重要作用。研究发现正常HRPE细胞基础性表达HLA-ABC，低表达HLA-DR及ICAM-1〔２，３〕。因此，RPE细胞移植排斥反应主要是慢性排斥反应。
T细胞的激活需要两种信号：第一信号主要来自T细胞的TCR与MHC分子-抗原复合物的特异性结合，CD4和CD8分子作为共受体分别与MHC-Ⅱ和MHC-Ⅰ类分子结合，增强T细胞与抗原提呈细胞间的粘附作用，参与第一信号的启动和转导；第二信号又称协同剌激信号，主要由T细胞和抗原提呈细胞表面粘附分子对的相互作用提供，最重要的是T细胞表面CD28分子与抗原提呈细胞表面相应配体B7-1（CD80）和B7-2（CD86）的结合。此外抗原提呈细胞细胞表达的其他协同剌激分子还包括VCAM-1、ICAM-1和LFA-3，它们分别与T细胞表面的VLA-4、LFA-1和CD2分子结合，共同提供T细胞活化的第二信号〔４-６〕。
研究发现体外传代培养时HRPE细胞HLA-ABC表达下调，表达量与传代代数呈负相关；体外传代培养时HRPE细胞ICAM-1表达上调，表达量与传代代数呈正相关；体外传代培养后HRPE细胞HLA-DR表达无明显变化。所以应用体外传代培养HRPE细胞进行移植时，由于HRPE细胞HLA-ABC表达下调，抗原性下降，可降低急性排斥反应的发生率。但由于ICAM-1表达增高，一方面可促使宿主白细胞迁移至视网膜下腔作为抗原提呈细胞，另一方面可增加T细胞激活的协同剌激信号，从而促进慢性排斥反应的发生。
参考文献
〔1〕Enzmann V, F Faude, P Wiedemann et al. Immunological problems of transplantation into the subretinal space[M]. Acta Anat (Basel), Jan 1998; 162(2-3): 178-83
〔2〕Sun D, Enzmann V, Lei S et al. Retinal pigment epithelial cells activate uveitogenic T cells when they express high levels of MHC class II molecules, but inhibit T cell activation when they express restricted levels[J]. J Neuroimmunol. 2003 Nov;144(1-2):1-8.
〔3〕Enzmann V, Hollborn M, Wiedemann P et al. Molecular and cellular evidence for T-cell stimulation by allogeneic retinal pigment epithelium cells in vitro[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2001 Jul;239(6):445-51.
〔4〕Enzmann V, Stadler M, Wiedemann P et al. In-vitro methods to decrease MHC class II-positive cells in retinal pigment epithelium cell grafts[J]. Ocul Immunol Inflamm. 1998 Sep;6(3):145-53.
〔5〕L Farrokh-Siar, KA Rezai, RT Semnani, SC Patel, JT Ernest, and GA van Seventer
Human fetal retinal pigment epithelium suppresses the activation of CD4(+) and CD8(+) T-cells[J].
Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, Nov 1999; 237(11): 934-9.
〔6〕L Farrokh-Siar, KA Rezai, EM Palmer et al. Cytokine modulation of costimulatory molecules on human fetal retinal pigment epithelial cells[J]. Curr Eye Res, Oct 2001; 23(4): 285-90.
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”