“以人为本”是我国高速铁路事业发展的基本出发点，高速列车乘坐舒适度的评估及优化是高速铁路技术发展的关键。而生理信号作为人体状态的直观反映，在评价乘员舒适度方面具有不可比拟的优势。心率变异性是心电信号中相邻心跳间期时间间隔的变化，可反映自主神经系统平衡状态。为研究心率变异性与高速列车乘员舒适度之间的关系，在沪昆高速铁路线上开展高速列车乘员舒适度实车实验，结合乘员主观舒适度问卷反馈结果，分析乘员的平均心跳间期、心跳间期标准差等10心率变异性特征在舒适度劣化时的变化情况。对乘员综合舒适度、振动舒适度、耳气压舒适度3类不同问题，使用T检验法分析各特征对“舒适”和“不舒适”状态的显著性，并建立基于随机森林算法的高速列车乘员舒适度评价模型。研究结果表明，心率变异性特征在不同类问题舒适度状态改变时，基本具有一致的变化趋势；其中平均心跳间期（Mean＿rr）与综合舒适度显著相关，心跳间期标准差（SDNN）及庞加莱图标准差（SD2）与振动舒适度显著相关；建立的舒适度识别模型对综合舒适度、振动舒适度及耳气压舒适度识别准确度分别达74.32%，70.67%及68.27%。