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摘 要：采用3种不同的萃取方法提取纯化速溶咖啡中的多菌灵，再利用高效液相色谱进行测定，根据净化方式的繁简和相对标准误差值，确定多菌灵适宜的提取方法。结果表明，超声提取的结果相对标准误差最小，可以考虑作为速溶咖啡中多菌灵残留量检测的参考方法。
关键词：速溶咖啡；多菌灵；超声提取；高效液相色谱
中图分类号 S571.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）06-135-02
Influence of Pretreatment Methods for the Determination of Carbendazim Content in Instant Coffee by HPLC
Liu Dandan1 et al.
（1Agricultural College，Yunnan University，Kunming 650091，China）
Abstract：Three different extraction and purification methods were performed to detect carbendazim residues in instant coffee using high performance liquid chromatography. The optimum method was selected according to the methods of extraction and purification and the percentage of relative standard deviation. The results indicated that ultrasonic pretreatment showed higher accuracy and lower relative error，compared with the other two pretreatment methods，and thus could be used as the reference method for the determination of carbendazim residues in instant by HPLC.
Key words：Instant coffee；Carbendazim；Ultrasonic pretreatment；HPLC
咖啡作为一种深受人们喜爱的饮品，对其需求量日益剧增。据有关数据统计，我国咖啡消费者的数量越来越大，其安全问题也逐渐成为公众关注的焦点。咖啡中的农业残留主要是由于种植过程中使用或环境中摄入的，常用的杀虫及杀菌剂有六六六、滴滴涕、乐果、百菌清、多菌灵、甲基托布津等[1]。随着农药的使用越来越多，环境中的农药残留也日益严重，已成为影响食品安全的瓶颈。这些农药的种类繁多，性质各异，在食品中的残留量极低，传统的分析方法难以保证其检测精度。目前，测定农药残留主要采用离子-气象色谱-质谱联用的方法[2]，但其测定费用较高且针对性较差。随着现代检测技术的进步，开发高效准确的农药残留检测方法，以及严格的农药限量标准尤其重要。目前，对于咖啡的农药残留检测均局限于对咖啡豆的检测[3]，还没有关于速溶咖啡检测的报道。农业部NY/T289—1995在标准中只是规定了六六六、滴滴涕2种农药的残留量及测定方法[4]。
多菌灵为内吸性光谱杀菌剂，对热稳定，对酸、碱不稳定，该农药一旦被植物吸收到体内即产生药效，是一种常见的杀菌剂。目前对于多菌灵农药残留的测定方法在黄瓜及茶叶中在咖啡豆中均有报道[1，4]，检测方法多为气相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等[2，5-7]。其中，质谱连用方法灵敏度高，但是价格昂贵，运行成本较高。因此，建立一种快速、高效、易推广的检测方法具有一定的现实意义。为此，本文通过加标回收使用3种不同的方法对速溶咖啡中的多菌灵进行提纯净化，通过比较探讨多菌灵最适宜的测定方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料 仪器：高效液相色谱仪（Waters，e2695），配2489型紫外可见检测器，超声波振荡仪器，旋转蒸发仪。标准品：多菌灵99.5%（购自国家标准物质中心）。试剂：甲醇、乙酸、盐酸、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、柠檬酸氢二钠、乙腈、氯化钠、无水硫酸钠、N-丙基乙二胺键合固相吸附剂，以上均购自阿拉丁试剂公司，色谱纯。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液的配置 准确称取适量的多菌灵标准品，先用少量的盐酸溶液微热溶解，再用该盐酸溶液定容，配成浓度为1.00mg/mL的标准储备溶液。
1.2.2 色谱条件 检测器：紫外检测器；检测波长：282nm；色谱柱：Waters SunFire C18（5μm，4.6×150mm）；流动相：A：甲醇（含2%乙酸）；B：水；0min，20%A80%B；1min，25%A75%B；12min，45%A55%B；13min，90%A 10%B；15min，20%A80%B；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量10μL。
1.2.3 样品前处理 本试验采用浓度为4.0mg/L多菌灵的农药处理速溶咖啡样品，采用3种不同的方法提取净化多菌灵进行液相色谱法测定，以便筛选最佳前处理方法。
1.2.3.1 处理1 （1）称取1g咖啡粉，用37μm（相当于400目）筛选，加入25.0mL乙腈，高速混匀2min。（2）加入15g无水硫酸镁，剧烈振摇1min，2 500r/min离心5min，静置30min分层。（3）取1.0mL乙腈于2mL离心管中，加入200mg无水硫酸镁和50mg PSA（N-丙基乙二胺），2 500r/min离心5min。（4）准确吸取0.5mL乙腈溶液，加入0.5mL离子对试剂，振荡后过0.45μm滤膜，待测。 1.2.3.2 处理2 （1）取称取1g样品，用37μm（相当于400目）筛选，放入250mL具塞三角瓶中。（2）加入100mL丙酮/水（50/50，v/v）提取液。浸泡0.5h后振荡提取1h。抽滤，量取滤液转入250mL分液漏斗中。（3）加入20mL饱和氯化钠溶液、50mL二氯甲烷。振荡萃取1min，静置分层，下层有机相过无水硫酸钠，水相再用二氯甲烷50mL萃取2次，合并3次萃取液，用旋转蒸发器（水浴温度40℃）浓缩，甲醇定容至1mL，待测。
1.2.3.3 处理3 （1）称取1g咖啡粉，用37μm（相当于400目）筛选，置于100mL具塞三角瓶中。（2）加入40mL甲醇，超声波（280W）振荡10min；然后在振荡器100r/min振荡30min提取。（3）加入1mol盐酸4mL，10g/L氯化钠40mL，混匀后加入40mL二氯甲烷。（4）水相用2mol氨水中和至pH值为7.5～8，返回分液漏斗中，加入40mL二氯甲烷，剧烈振荡，静置分层。（5）有机相过无水硫酸钠柱至平底烧瓶中，水相中再加入二氯甲烷40mL，重复操作，二氯甲烷分2次从水溶液中提取多菌灵，合并有机相，40℃进行减压蒸馏。（6）残渣先用2mL甲醇溶解，移入10mL容量瓶中，清洗2次，定容，过0.45μm微孔滤膜后于液相色谱测定，每个样品重复3次。
2 结果与分析
从图1可以看出，多菌灵标准品的出峰时间为14.488min，峰图对称性好，没有出现拖尾现象。以样品浓度x（mg/L）对峰面积y求出回归方程并绘制标准曲线。多菌灵标准曲线方程为：y=33427x+410.7；相关系数r2=0.999。
用标准品处理的咖啡样品中多菌灵的含量，结果如表1。由表1可知，处理3（超声提取净化法）纯化得到的多菌灵的含量为4.58mg/L，与加入标准品的浓度最接近，相对标准偏差（RSD）和相对误差均较小，说明该方法测定得到的结果最准确；处理1和处理2提取纯化多菌灵的方法虽简单，但测定的含量偏低，结果不稳定，并且回收率均偏低，这2种方法还需改进。处理3由于经过多次纯化，测定方法准确，精密度较高，可以作为测定多菌灵的推荐方法。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部标准.黄瓜中百菌清残留量的测定[S].北京：中国标准出版社，2004.（GB/T 5009.105-2003）.
[2]王登飞，陈练洪，游俊，等.固相萃取-HPLC法同时测定果蔬中多菌灵和噻菌灵残留量[J].农药，2008，47（6）：443-447.
[3]刘春华，乐渊，阳辛风，等.超高效液相色谱一串联质谱法快速测定[J].广东农业科学，2012，24：108-110.
[4]中华人民共和国农业部.小粒种咖啡病虫害防治技术规程（NY/T1698-2009）[S].
[5]薛思佳，贺红武，王涛，等.新颖除草剂研究进展[J].化学世界，2002，11（11）：608-614.
[6]饶钦雄，曲明清，赵晓燕，等.HPLC法测定常见蔬菜水果中多菌灵、噻菌灵和苯菌灵残留量[J].上海农业学报，2009，25（4）：85-88.
[7]王学贵，张琴，徐汉虹，等.高效液相色谱测定茶叶中多菌灵的残留[J].农药，2009，48（1）：55-57.
（责编：张宏民）
关键词：速溶咖啡；多菌灵；超声提取；高效液相色谱
中图分类号 S571.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）06-135-02
Influence of Pretreatment Methods for the Determination of Carbendazim Content in Instant Coffee by HPLC
Liu Dandan1 et al.
（1Agricultural College，Yunnan University，Kunming 650091，China）
Abstract：Three different extraction and purification methods were performed to detect carbendazim residues in instant coffee using high performance liquid chromatography. The optimum method was selected according to the methods of extraction and purification and the percentage of relative standard deviation. The results indicated that ultrasonic pretreatment showed higher accuracy and lower relative error，compared with the other two pretreatment methods，and thus could be used as the reference method for the determination of carbendazim residues in instant by HPLC.
Key words：Instant coffee；Carbendazim；Ultrasonic pretreatment；HPLC
咖啡作为一种深受人们喜爱的饮品，对其需求量日益剧增。据有关数据统计，我国咖啡消费者的数量越来越大，其安全问题也逐渐成为公众关注的焦点。咖啡中的农业残留主要是由于种植过程中使用或环境中摄入的，常用的杀虫及杀菌剂有六六六、滴滴涕、乐果、百菌清、多菌灵、甲基托布津等[1]。随着农药的使用越来越多，环境中的农药残留也日益严重，已成为影响食品安全的瓶颈。这些农药的种类繁多，性质各异，在食品中的残留量极低，传统的分析方法难以保证其检测精度。目前，测定农药残留主要采用离子-气象色谱-质谱联用的方法[2]，但其测定费用较高且针对性较差。随着现代检测技术的进步，开发高效准确的农药残留检测方法，以及严格的农药限量标准尤其重要。目前，对于咖啡的农药残留检测均局限于对咖啡豆的检测[3]，还没有关于速溶咖啡检测的报道。农业部NY/T289—1995在标准中只是规定了六六六、滴滴涕2种农药的残留量及测定方法[4]。
多菌灵为内吸性光谱杀菌剂，对热稳定，对酸、碱不稳定，该农药一旦被植物吸收到体内即产生药效，是一种常见的杀菌剂。目前对于多菌灵农药残留的测定方法在黄瓜及茶叶中在咖啡豆中均有报道[1，4]，检测方法多为气相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法等[2，5-7]。其中，质谱连用方法灵敏度高，但是价格昂贵，运行成本较高。因此，建立一种快速、高效、易推广的检测方法具有一定的现实意义。为此，本文通过加标回收使用3种不同的方法对速溶咖啡中的多菌灵进行提纯净化，通过比较探讨多菌灵最适宜的测定方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料 仪器：高效液相色谱仪（Waters，e2695），配2489型紫外可见检测器，超声波振荡仪器，旋转蒸发仪。标准品：多菌灵99.5%（购自国家标准物质中心）。试剂：甲醇、乙酸、盐酸、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、柠檬酸氢二钠、乙腈、氯化钠、无水硫酸钠、N-丙基乙二胺键合固相吸附剂，以上均购自阿拉丁试剂公司，色谱纯。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液的配置 准确称取适量的多菌灵标准品，先用少量的盐酸溶液微热溶解，再用该盐酸溶液定容，配成浓度为1.00mg/mL的标准储备溶液。
1.2.2 色谱条件 检测器：紫外检测器；检测波长：282nm；色谱柱：Waters SunFire C18（5μm，4.6×150mm）；流动相：A：甲醇（含2%乙酸）；B：水；0min，20%A80%B；1min，25%A75%B；12min，45%A55%B；13min，90%A 10%B；15min，20%A80%B；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量10μL。
1.2.3 样品前处理 本试验采用浓度为4.0mg/L多菌灵的农药处理速溶咖啡样品，采用3种不同的方法提取净化多菌灵进行液相色谱法测定，以便筛选最佳前处理方法。
1.2.3.1 处理1 （1）称取1g咖啡粉，用37μm（相当于400目）筛选，加入25.0mL乙腈，高速混匀2min。（2）加入15g无水硫酸镁，剧烈振摇1min，2 500r/min离心5min，静置30min分层。（3）取1.0mL乙腈于2mL离心管中，加入200mg无水硫酸镁和50mg PSA（N-丙基乙二胺），2 500r/min离心5min。（4）准确吸取0.5mL乙腈溶液，加入0.5mL离子对试剂，振荡后过0.45μm滤膜，待测。 1.2.3.2 处理2 （1）取称取1g样品，用37μm（相当于400目）筛选，放入250mL具塞三角瓶中。（2）加入100mL丙酮/水（50/50，v/v）提取液。浸泡0.5h后振荡提取1h。抽滤，量取滤液转入250mL分液漏斗中。（3）加入20mL饱和氯化钠溶液、50mL二氯甲烷。振荡萃取1min，静置分层，下层有机相过无水硫酸钠，水相再用二氯甲烷50mL萃取2次，合并3次萃取液，用旋转蒸发器（水浴温度40℃）浓缩，甲醇定容至1mL，待测。
1.2.3.3 处理3 （1）称取1g咖啡粉，用37μm（相当于400目）筛选，置于100mL具塞三角瓶中。（2）加入40mL甲醇，超声波（280W）振荡10min；然后在振荡器100r/min振荡30min提取。（3）加入1mol盐酸4mL，10g/L氯化钠40mL，混匀后加入40mL二氯甲烷。（4）水相用2mol氨水中和至pH值为7.5～8，返回分液漏斗中，加入40mL二氯甲烷，剧烈振荡，静置分层。（5）有机相过无水硫酸钠柱至平底烧瓶中，水相中再加入二氯甲烷40mL，重复操作，二氯甲烷分2次从水溶液中提取多菌灵，合并有机相，40℃进行减压蒸馏。（6）残渣先用2mL甲醇溶解，移入10mL容量瓶中，清洗2次，定容，过0.45μm微孔滤膜后于液相色谱测定，每个样品重复3次。
2 结果与分析
从图1可以看出，多菌灵标准品的出峰时间为14.488min，峰图对称性好，没有出现拖尾现象。以样品浓度x（mg/L）对峰面积y求出回归方程并绘制标准曲线。多菌灵标准曲线方程为：y=33427x+410.7；相关系数r2=0.999。
用标准品处理的咖啡样品中多菌灵的含量，结果如表1。由表1可知，处理3（超声提取净化法）纯化得到的多菌灵的含量为4.58mg/L，与加入标准品的浓度最接近，相对标准偏差（RSD）和相对误差均较小，说明该方法测定得到的结果最准确；处理1和处理2提取纯化多菌灵的方法虽简单，但测定的含量偏低，结果不稳定，并且回收率均偏低，这2种方法还需改进。处理3由于经过多次纯化，测定方法准确，精密度较高，可以作为测定多菌灵的推荐方法。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部标准.黄瓜中百菌清残留量的测定[S].北京：中国标准出版社，2004.（GB/T 5009.105-2003）.
[2]王登飞，陈练洪，游俊，等.固相萃取-HPLC法同时测定果蔬中多菌灵和噻菌灵残留量[J].农药，2008，47（6）：443-447.
[3]刘春华，乐渊，阳辛风，等.超高效液相色谱一串联质谱法快速测定[J].广东农业科学，2012，24：108-110.
[4]中华人民共和国农业部.小粒种咖啡病虫害防治技术规程（NY/T1698-2009）[S].
[5]薛思佳，贺红武，王涛，等.新颖除草剂研究进展[J].化学世界，2002，11（11）：608-614.
[6]饶钦雄，曲明清，赵晓燕，等.HPLC法测定常见蔬菜水果中多菌灵、噻菌灵和苯菌灵残留量[J].上海农业学报，2009，25（4）：85-88.
[7]王学贵，张琴，徐汉虹，等.高效液相色谱测定茶叶中多菌灵的残留[J].农药，2009，48（1）：55-57.
（责编：张宏民）