论文部分内容阅读
作者单位：450003 河南省人民医院
通讯作者：杨海涛
【摘要】 目的 探讨Chelex-100法提取先天性长QT综合征相关人类真核表达质粒pcDNA3-HERG的可行性。方法 分别用Chelex-100法和碱裂解法提取pcDNA3-HERG质粒，将环状质性DNA酶切为线性，0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测质粒提取的有效性。结果 用Chelex-100法和碱裂解法提取的pcDNA3-HERG质粒的OD（A260/A280）比较差异无统计学意义［分别为（1.8±0.6），（1.9±0.4），P>0.05］，经0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测均有特定的清晰条带。结论 两种方法均能提取纯度较高的大肠杆菌质粒DNA，Chelex-100法简便、省时，值得推广。
【关键词】 pcDNA3-HERG； 真核表达质粒质粒； Chelex-100 法； SDS-碱裂解法
doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2012.06.093
先天性长QT综合征（long QT syndrome，LQTS）是由于编码心肌离子通道蛋白的基因突变导致心肌细胞膜离子通道功能障碍而引起的一组临床综合征。目前已发现了10个LQTS的相关基因，其中HERG基因突变引起编码心脏延迟整流钾电流功能障碍的长QT综合征在中国较为常见。人类真核表达质粒pcDNA3-HERG是研究该蛋白功能的有效工具。经典的碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，适合于所有生物检材，且提取的质粒纯度高，但操作繁琐、复杂、费时，本文旨在探讨一种新的操作步骤简单、省时提取质粒的方法，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 大肠杆菌质粒来源 大肠杆菌感受态细胞DH5a：北京天为时代生物公司。
1.2 主要试剂 质粒pcDNA3-HERG：美国Wisconsin大学Anson BD博士惠赠，Chelex-100（Bio-Rad），DL2000marker（北京天为时代生物公司），碱裂解法质粒小量制备试剂盒DP2602（北京百泰克），固体培养基，限制性内切酶BamHI（购自Promega公司），50×TAE，溴化乙锭（EB），0.8%琼脂糖凝胶，其余试剂均为进口及国产。
1.3 主要设备 小型DNA电泳仪及电泳槽（日本产）、低温离心机（Backman）、电磁炉（上海产），WP型紫外透射反射分析仪（上海医疗器械厂）、可见分光光度机（日本岛津，UV-2401PC型）、全自动凝胶成像及分析系统（法国VL）、电热恒温水浴箱（上海医疗器械厂）。
1.4 大肠杆菌的培养 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0 ml LB（含氨苄青霉素）液体培养基中，37 ℃、250 g振荡培养过夜（约12~14 h）。
1.5 SDS-碱裂解法提取质粒pcDNA3-HERG 于1.5 ml Ep管中加入1.5 ml大肠杆菌液，按照碱裂解法质粒小量制备试剂盒DP2602说明书进行操作，最终用70 μl EB洗脱缓冲液将大肠杆菌质粒DNA洗脱保存。
1.6 Chelex-100提取质粒pcDNA3-HERG 于1.5 ml Ep管中加入1.5 ml大肠杆菌液轻轻振荡5 min，以求充分混匀，12 000 r/min离心2 min，去上清液，加200 μl 5% Chelex-100，56 ℃保温30 min，剧烈振荡5 s，沸水煮8 min，1000 r/min离心3 min，上清液即含用于酶切的质粒DNA样品。
1.7 质粒DNA定量 在微量紫外分光光度计上分别测两种不同方法提取质粒DNA的吸光度（A，曾称光密度OD）值。
1.8 琼脂糖凝胶电泳鉴定 将获得的环状质粒用BamHI酶切为线性，反应体系如表１，快速混匀后，置37 ℃水浴1.5 h后，酶切产物经0.8%含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
表1 酶切反应体系（μl）
试剂体积
pcDNA310
BSA2
Buffer（10×）5
灭菌去离子水12
BamHI1
1.9 统计学处理 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用两样本均数t检验法进行统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 同体积大肠杆菌液提取的质粒DNA获得量（A260/A280）分别为（1.8±0.6）、（1.9±0.4），两种方法比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 用两种方法提取的质粒DNA片段均为9.3 kp，且条带清晰可见（图1）。
注：1为Chelex-100 法提取的质粒，2为SDS-碱裂解法提取的质粒
3 讨论
质粒pcDNA3-HERG和细胞内DNA不同的是质粒呈环状，作为表达载体有其特有cDNA启动子等其表达所需要的上游调节片断。但其实质仍然是DNA，因此，笔者尝试用提取DNA的方法来提取质粒pcDNA3-HERG。
本文用经典的碱裂解法和Chelex-100法分别提取质粒pcDNA3-HERG，然后把环状的质粒酶切成单链DNA，进行鉴定。结果显示，在琼脂糖电泳上都出现了特定区带，而且Chelex100法也可成功提取纯度较高的质粒pcDNA3-HERG。
经典的碱裂解法的基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中，蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来，这是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，适合于所有生物检材，且提取的质粒纯度高，但操作繁琐、复杂、费时［1］。
Chelex-100是一种螯合型离子交换树脂，由苯乙烯和苯乙二烯组成的聚合物，Chelex悬液在100 ℃煮沸时可使蛋白质变性，大肠杆菌细胞壁破裂，质粒从细胞中释放［2］。Chelex与二价金属离子螯合，从而避免样品中存在的金属离子在高温和低离子强度溶液中作为催化剂使DNA降解，Chelex还能够抑制核酸酶对DNA的消化作用，并在高温、低离子强度条件下催化DNA的释放。它已广泛应用于微量血液、组织块、精斑、骨骼及牙齿等法医物证检材［3］，这样的处理过程既达到了分离提取DNA的目的，同时除去了一些影响酶切反应以及免疫化学反应的因子（如重金属离子），提高了质粒pcDNA3-HERG在细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等实验过程中的利用率。该方法简便快速，无腐蚀，提取过程始终在同一试管中进行，可减少DNA的损失，由于操作步骤简单，减少了污染机会。Sepp等［4］研究认为，由于高温对DNA有一定程度的降解作用，使得Chelex-100法提取的DNA片段在1000 bp以下，但是笔者的结果说明该方法可以成功提出大于1000 bp的质粒。
参 考 文 献
［1］ Sambrook J，Frist sch EF，Maniatist，et al.Molecular cloning-a laboratory manual［J］.2nd.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989:119-122.
［2］ Stein A，Raoult D.A simple method for amplification of DNA from paraffin- embedded tissues［J］.Nucleic Acids Res，1992，20:5237.
［3］ Walsh PS，Metzger DA，Higuchi R.Chelex-100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material ［J］.Biotechniques，1991，10（4）:506-513.
［4］ Sepp R，Szabo I，Uda H，et al.Rapid techniques for DNA extraction from routinely processed archival tissue for use in PCR［J］.J Clin Pathol，1994，47:318-323.
（收稿日期：2011-12-19）
（本文编辑：连胜利）
通讯作者：杨海涛
【摘要】 目的 探讨Chelex-100法提取先天性长QT综合征相关人类真核表达质粒pcDNA3-HERG的可行性。方法 分别用Chelex-100法和碱裂解法提取pcDNA3-HERG质粒，将环状质性DNA酶切为线性，0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测质粒提取的有效性。结果 用Chelex-100法和碱裂解法提取的pcDNA3-HERG质粒的OD（A260/A280）比较差异无统计学意义［分别为（1.8±0.6），（1.9±0.4），P>0.05］，经0.8%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下检测均有特定的清晰条带。结论 两种方法均能提取纯度较高的大肠杆菌质粒DNA，Chelex-100法简便、省时，值得推广。
【关键词】 pcDNA3-HERG； 真核表达质粒质粒； Chelex-100 法； SDS-碱裂解法
doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2012.06.093
先天性长QT综合征（long QT syndrome，LQTS）是由于编码心肌离子通道蛋白的基因突变导致心肌细胞膜离子通道功能障碍而引起的一组临床综合征。目前已发现了10个LQTS的相关基因，其中HERG基因突变引起编码心脏延迟整流钾电流功能障碍的长QT综合征在中国较为常见。人类真核表达质粒pcDNA3-HERG是研究该蛋白功能的有效工具。经典的碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，适合于所有生物检材，且提取的质粒纯度高，但操作繁琐、复杂、费时，本文旨在探讨一种新的操作步骤简单、省时提取质粒的方法，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 大肠杆菌质粒来源 大肠杆菌感受态细胞DH5a：北京天为时代生物公司。
1.2 主要试剂 质粒pcDNA3-HERG：美国Wisconsin大学Anson BD博士惠赠，Chelex-100（Bio-Rad），DL2000marker（北京天为时代生物公司），碱裂解法质粒小量制备试剂盒DP2602（北京百泰克），固体培养基，限制性内切酶BamHI（购自Promega公司），50×TAE，溴化乙锭（EB），0.8%琼脂糖凝胶，其余试剂均为进口及国产。
1.3 主要设备 小型DNA电泳仪及电泳槽（日本产）、低温离心机（Backman）、电磁炉（上海产），WP型紫外透射反射分析仪（上海医疗器械厂）、可见分光光度机（日本岛津，UV-2401PC型）、全自动凝胶成像及分析系统（法国VL）、电热恒温水浴箱（上海医疗器械厂）。
1.4 大肠杆菌的培养 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0 ml LB（含氨苄青霉素）液体培养基中，37 ℃、250 g振荡培养过夜（约12~14 h）。
1.5 SDS-碱裂解法提取质粒pcDNA3-HERG 于1.5 ml Ep管中加入1.5 ml大肠杆菌液，按照碱裂解法质粒小量制备试剂盒DP2602说明书进行操作，最终用70 μl EB洗脱缓冲液将大肠杆菌质粒DNA洗脱保存。
1.6 Chelex-100提取质粒pcDNA3-HERG 于1.5 ml Ep管中加入1.5 ml大肠杆菌液轻轻振荡5 min，以求充分混匀，12 000 r/min离心2 min，去上清液，加200 μl 5% Chelex-100，56 ℃保温30 min，剧烈振荡5 s，沸水煮8 min，1000 r/min离心3 min，上清液即含用于酶切的质粒DNA样品。
1.7 质粒DNA定量 在微量紫外分光光度计上分别测两种不同方法提取质粒DNA的吸光度（A，曾称光密度OD）值。
1.8 琼脂糖凝胶电泳鉴定 将获得的环状质粒用BamHI酶切为线性，反应体系如表１，快速混匀后，置37 ℃水浴1.5 h后，酶切产物经0.8%含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
表1 酶切反应体系（μl）
试剂体积
pcDNA310
BSA2
Buffer（10×）5
灭菌去离子水12
BamHI1
1.9 统计学处理 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用两样本均数t检验法进行统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 同体积大肠杆菌液提取的质粒DNA获得量（A260/A280）分别为（1.8±0.6）、（1.9±0.4），两种方法比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 用两种方法提取的质粒DNA片段均为9.3 kp，且条带清晰可见（图1）。
注：1为Chelex-100 法提取的质粒，2为SDS-碱裂解法提取的质粒
3 讨论
质粒pcDNA3-HERG和细胞内DNA不同的是质粒呈环状，作为表达载体有其特有cDNA启动子等其表达所需要的上游调节片断。但其实质仍然是DNA，因此，笔者尝试用提取DNA的方法来提取质粒pcDNA3-HERG。
本文用经典的碱裂解法和Chelex-100法分别提取质粒pcDNA3-HERG，然后把环状的质粒酶切成单链DNA，进行鉴定。结果显示，在琼脂糖电泳上都出现了特定区带，而且Chelex100法也可成功提取纯度较高的质粒pcDNA3-HERG。
经典的碱裂解法的基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中，蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来，这是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，适合于所有生物检材，且提取的质粒纯度高，但操作繁琐、复杂、费时［1］。
Chelex-100是一种螯合型离子交换树脂，由苯乙烯和苯乙二烯组成的聚合物，Chelex悬液在100 ℃煮沸时可使蛋白质变性，大肠杆菌细胞壁破裂，质粒从细胞中释放［2］。Chelex与二价金属离子螯合，从而避免样品中存在的金属离子在高温和低离子强度溶液中作为催化剂使DNA降解，Chelex还能够抑制核酸酶对DNA的消化作用，并在高温、低离子强度条件下催化DNA的释放。它已广泛应用于微量血液、组织块、精斑、骨骼及牙齿等法医物证检材［3］，这样的处理过程既达到了分离提取DNA的目的，同时除去了一些影响酶切反应以及免疫化学反应的因子（如重金属离子），提高了质粒pcDNA3-HERG在细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等实验过程中的利用率。该方法简便快速，无腐蚀，提取过程始终在同一试管中进行，可减少DNA的损失，由于操作步骤简单，减少了污染机会。Sepp等［4］研究认为，由于高温对DNA有一定程度的降解作用，使得Chelex-100法提取的DNA片段在1000 bp以下，但是笔者的结果说明该方法可以成功提出大于1000 bp的质粒。
参 考 文 献
［1］ Sambrook J，Frist sch EF，Maniatist，et al.Molecular cloning-a laboratory manual［J］.2nd.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989:119-122.
［2］ Stein A，Raoult D.A simple method for amplification of DNA from paraffin- embedded tissues［J］.Nucleic Acids Res，1992，20:5237.
［3］ Walsh PS，Metzger DA，Higuchi R.Chelex-100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material ［J］.Biotechniques，1991，10（4）:506-513.
［4］ Sepp R，Szabo I，Uda H，et al.Rapid techniques for DNA extraction from routinely processed archival tissue for use in PCR［J］.J Clin Pathol，1994，47:318-323.
（收稿日期：2011-12-19）
（本文编辑：连胜利）