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摘要：为了从菌糠中筛选高产纤维素酶的菌株，鉴定并优化其培养条件，利用纤维素刚果红筛选平板初筛，摇瓶复筛后得到菌株，鉴定后通过响应面法优化培养条件。结果表明，分离筛选得到的高产纤维素酶的菌株，经过形态观察、生理生化鉴定以及16S rRNA序列分析，初步鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），命名為S-4。采用响应面法对菌株S-4进行增殖条件的优化，得到3个显著因子，分别为葡萄糖添加量13.08 g/L，蛋白胨添加量 6.52 g/L，KH2PO4添加量0.37 g/L。通过响应面法优化后，活菌量比初始培养提高了34.49%。
关键词：菌糠；枯草芽孢杆菌；纤维素酶；响应面法；培养基优化
中图分类号：S816.3 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2016）11-0457-03
菌糠是培育食用菌后所剩的糠类物质，含有丰富的纤维素、粗蛋白等营养物质。随着我国对食用菌需求量的加大，菌糠的产量也大大增加，菌糠资源的二次利用以及环境保护等方面面临极大的挑战[1-2]。近年来的大量研究表明，利用微生物发酵菌糠可以制成微生物制剂及饲料，纤维素、木质素等被不同程度地降解，粗蛋白、粗脂肪均高于未经发酵的基质，可以缓解资源的浪费[3]。另外，将菌糠制备成益生菌制剂用于动物饲养，不仅有利于动物的消化吸收，而且降低了饲料成本[4-5]。
以往研究中的发酵菌糠所用菌株多为保藏菌种，关于菌糠中菌种利用的报道很少。本试验从菌糠中筛选出1株产纤维素酶能力强的菌株S-4，该菌株产生的纤维素酶可以更好地利用菌糠中的纤维素，降低纤维素含量。经生理生化、16S rRNA序列对比及分析鉴定，菌株S-4为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），羧甲基纤维素酶（carboxymethyl cellulase enzyme，CMCase）活力为67.5 U/ml。采用软件Design-Expert 8.0的Plackett-Burman试验筛选出对响应值影响较大的3个因素，利用最陡爬坡试验逼近最大响应区域，用Box-Behnken试验进一步优化得到最大响应值及最优增殖条件。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品 菌糠样品由河北农业大学动物科技学院提供。
1.1.2 试剂 羧甲基纤维素钠（简称CMC-Na）、酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏均由北京奥博星有限公司提供。MgSO4·7H2O、K2HPO4、KH2PO4、葡萄糖由天津福晨化学试剂厂提供。
1.1.3 培养基 牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、加水补足至1 000 mL，pH值7.0～8.0，121 ℃ 灭菌20 min，备用；发酵产酶培养基：CMC-Na 10 g、KH2PO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、酵母粉5 g，加水补足至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min，备用。刚果红筛选培养基：CMC-Na 2 g、（NH4）2SO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 1 g、NaCl 0.5 g、刚果红0.4 g、琼脂20 g，加水补足至1 000 mL，pH值7.0，121 ℃灭菌30 min。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株筛选
1.2.1.1 富集培养 菌糠中添加2%糖蜜、1%硫酸铵、60%水，于30 ℃恒温培养箱中培养48 h。将发酵后的菌糠按 1 ∶9 的比例置于生理盐水中，静置30 min，5 000 r/min离心 5 min，将离心后得到的菌悬液进行梯度稀释，涂布后于30 ℃恒温培养箱倒置培养48 h。
1.2.1.2 产纤维素酶菌株初筛 将培养后的菌糠按1 ∶9的比例溶于生理盐水中，5 000 r/min离心5 min，将离心后得到的菌悬液进行梯度稀释，并涂布于刚果红筛选培养基上，37 ℃ 培养24 h后放置2 d，测量透明圈直径与菌落直径，挑选出透明圈直径与菌落直径比值（简称圈菌比）较大的作为初筛菌株[6-7]，在刚果红初筛平板上进行划线分离纯化，并于斜面保存菌种。
1.2.1.3 产纤维素酶菌株复筛 将初筛得到的菌株接种到产酶培养基中，于37 ℃、160 r/min培养48 h，后于4 ℃、5 000 r/min 离心10 min，测定上清液的羧甲基纤维素酶活性[8]。
1.2.2 菌株鉴定
1.2.2.1 形态学特征及生理生化鉴定 观察菌株的菌落形态，革兰氏染色后观察菌株显微形态。利用细菌微量生化鉴定管进行生理生化鉴定[9]。
1.2.2.2 菌株的基因鉴定 提取菌株的基因组，并对基因组进行扩增，采用试剂盒割胶回收之后连接片段，进行热转化，对基因片段进行PCR扩增。扩增引物的合成以及测序工作由华大基因完成。得到16S序列后，在NCBI系统通过Blast进行序列比对分析，利用Mega 5.0软件的邻接法创建系统发育树[10-12]。
1.2.3 响应面法优化菌株S-4发酵条件 通过Plackett-Burman（PB）试验设计，从7个试验因素中筛选出3个显著影响因子[13-14]，利用最陡爬坡试验，使因素水平值逼近最大响应区域，结合响应面法BB试验设计进一步研究，并利用Design Expert软件进行回归分析[15-16]，寻求最佳水平，得到最优发酵条件[17]。
2 结果与分析
2.1 菌糠筛菌
由表1可知，圈菌比最大的菌株S-4为产纤维素酶能力最强的菌株。
摇瓶发酵复筛结果显示，菌株S-1、S-4的CMC活性分别为22.4、67.5 U/mL（表2）。综合圈菌比和CMC活性可知，S-4为目的菌株。 2.2 菌株S-4的鉴定
2.2.1 形态学特征及生理生化鉴定 形态观察表明，菌株 S-4 菌落形态为圆形，边缘不整齐，表面褶皱，干燥不透明，白色；液体培养形成菌膜，分层明显；经过染色后，油镜下观察到菌体形态为杆状，单个排列，革兰氏染色阳性，有芽孢。表3为菌株S-4的生理生化鑒定结果。
2.2.2 菌株的分子鉴定 提取菌株S-4的基因，进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖电泳。S-4菌株16S rRNA序列的扩增产物约为1 500 bp。序列信息在NCBI进行Blast比对，S-4菌株16S rRNA序列与枯草芽孢杆菌的16S rRNA序列同源性为97%。从系统进化发育树分析可知，菌株S-4与枯草芽孢杆菌的16S rRNA序列相似度最高（图1）。结合序列对比分析，初步判断菌株S-4为枯草芽孢杆菌。
2.3 响应面法优化菌株S-4发酵条件
2.3.1 PB试验 以枯草芽孢杆菌S-4为试验菌株，以菌悬液D546 nm为响应值，于37 ℃、160 r/min摇床发酵，分析影响发酵的7个因素：A，葡萄糖；B，酵母粉；C，KH2PO4；D，K2HPO4；E，MgSO4；F，蛋白胨；G，牛肉膏。由表4可见，该模型相关性极显著（P值=0.000 1<0.01），在90%的置信区间内，对于活菌量影响显著的3个因素依次为A：葡萄糖，F：蛋白胨，C：KH2PO4，以此作进一步的响应面分析。
2.3.2 最陡爬坡试验 根据一阶方程，确定其变化的步长以及方向，试验组合设计及结果见表5，可见第2组的Y值（D546 nm），即发酵后菌液中菌种生物含量最高。因此， 将葡萄糖含量12 g/L、蛋白胨含量6 g/L、KH2PO4含量0.4 g/L作为后续响应面Box-Behnken试验的中心点。
2.3.3 响应面Box-Behnken试验 在本研究的条件和方法的基础上，将A（葡萄糖12 g/L）、B（蛋白胨6 g/L）、C（KH2PO4 0.4 g/L）作为Box-Behnken试验的中心点，采用Design Expert 8.0软件对Box-Behnken试验结果进行方差分析和二次多项拟合。由表6可知，模型的P值=0.000 4，此模型高度显著，可信度高。A、C、AB、BC、A2、B2、C2对响应值都有显著影响，表明3个因素对响应值不是简单的线性关系。另外模型的R2=0.966 2，校正R2=0.913 7，说明该模型可以很好地模拟和验证试验的结果。变异系数为1.77%，置信度比较高，说明模型可以反映真实的试验值。
2.3.4 响应面分析 采用响应面法分析研究培养基成分，将PB试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验结合。结果显示，当3个显著因子分别为葡萄糖含量为13.08 g/L、蛋白胨含量为6.52 g/L、KH2PO4含量为0.37 g/L时，优化后活菌量比初始培养提高了34.49%。由图2、图3、图4可知，AB、BC之间具有十分明显的交互作用，AC之间的交互作用较小。为了验证结果的可靠性，保证发酵条件一致，分别于基础培养基、优化后的培养基中对菌株S-4进行试验，每组3个平行，并取平均值，得到优化后的D546 nm为3.478±0.034，与响应面分析预测结果拟合良好，基础培养基D546 nm为2.586±0.026，优化后的D546 nm比初始培养的提高了34.49%。
3 讨论与结论
通过对菌糠样品富集培养，利用纤维素筛选平板初筛、摇瓶发酵复筛，得到1株高产纤维素酶的菌株S-4。经过生理生化鉴定，并结合16S rRNA序列对比分析，鉴定为枯草芽孢杆菌，CMC活性为67.5 U/mL。采用响应面法分析培养基成分得出，当3个显著因子分别为葡萄糖含量 13.08 g/L、蛋白胨含量6.52 g/L、KH2PO4含量0.37 g/L时，优化后活菌量比初始培养提高了34.49%。枯草芽孢杆菌为饲用益生菌，且高产纤维素酶，用它来发酵菌糠，不仅可以降低粗纤维的含量，还能提高蛋白含量。枯草芽孢杆菌也可以提高动物肠道内的消化利用率[18-19]。响应面法优化增殖培养条件，试验次数少，周期较短，且对影响试验的各个因素进行分析总结，分析显著影响因子之间的交互作用，是一种高效优化发酵条件的途径[20-22]。
参考文献：
[1]张 昂. 菌糠的营养价值及其在畜禽生产中的应用[J]. 畜牧与饲料学，2014，35（7/8）：46-47.
[2]卜文文，陶 鸿，赵大刚，等. 食用菌菌糠综合再利用研究概述[J]. 中国瓜菜，2012（3）：40-43.
[3]卫智涛，周国英，胡清秀. 食用菌菌渣利用研究现状[J]. 中国食用菌，2010，29（5）：3-6， 11.
[4]陈世通，李梦杰，李荣春. 食用菌菌糠综合利用的研究现状[J]. 北方园艺，2011（19）：152-154.
[5]周 巍，盛萱宜，彭霞薇，等. 菌糠的综合利用研究进展[J]. 生物技术，2011，21（2）：94-97.
[6]张丽影，汪寒寒，潘 婷，等. 产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件优化[J]. 纤维素科学与技术，2015，23（2）：1-7.
[7]李冠杰，刘莹莹，甄 静，等. 一株降解纤维素细菌的分离、鉴定及酶学性质分析[J]. 河南科学，2015，4：530-534.
[8]孙 盈，田永强，赵丽坤. 纤维素酶的CMC酶活测定条件的研究[J]. 食品工业科技，2013，34（2）：68-71.
[9]廖延雄. 《伯杰氏鉴定细菌学手册》与《伯杰氏分类细菌学手册》[J]. 微生物学通报，1992（4）：249.
[10]黄春凯，左小明，王红蕾，等. 一株产纤维素酶菌株的分离，鉴定及产酶特性[J]. 微生物学通报，2015，42（4）：646-653. [11]Yuan L，Wang W，Pei Y Y，et al. Screening and identification of cellulase-producing strain of Fusarium oxysporum[J]. Procedia Environmental Sciences，2012，12：1213-1219.
[12]孙一博. 高效纤维素降解菌的筛选鉴定及特性研究[D]. 哈尔滨：东北农业大学，2013.
[13]张 欢，丛丽娜，侯英敏，等. 响应面法优化海洋枯草芽孢杆菌HS-A38增殖发酵培养基[J]. 大连工业大学学报，2012，31（1）：19-23.
[14]胡丽娟，薛高尚，卢向阳，等. 响应面法优化芽孢杆菌25-2产纤维素酶发酵条件[J]. 酿酒科技，2012（4）：21-26.
[15]张 瑶，李 啸，潘冬瑞. Box-Benhnken设计优化植物乳杆菌培养基[J]. 天津农业科学，2013，19（7）：1-5.
[16]赵延存，李鹏霞，黄开红，等. 适于解淀粉芽孢杆菌BGP20菌体生长的培养基响应面优化[J]. 食品科学，2014，35（3）：157-162.
[17]Myers W R. Encycloedia of biopharmaceutical statistics[M]. New York：Marcel Dekker，2003：858-869.
[18]张丽美，王秀玲，韩梅琳，等. 枯草芽孢杆菌发酵菌糠制备饲料微生物添加剂的研究[J]. 饲料工业，2013，34（2）：49-53.
[19]刘伯实. 纤维素酶产生菌的筛选及其在菌糠开发中的利用[D]. 天津：天津大学，2008.
[20]库米拉·马吉提，王 伟，张晓燕，等. 响应面法优化枯草芽孢杆菌发酵产低温淀粉酶的工艺条件[J]. 新疆农业大学学报，2012，35（6）：478-483.
[21]王雪莲，王 敏，骆健美，等. 枯草芽孢杆菌生防菌B579最佳培养基响应面法優化[J]. 江苏农业学报，2009，25（1）：212-215.
[22]陈 羽，冯 镇，张宏伟，等. 响应面法优化芽孢杆菌FC96培养基组分的研究[J]. 食品科技，2011（6）：30-34.
关键词：菌糠；枯草芽孢杆菌；纤维素酶；响应面法；培养基优化
中图分类号：S816.3 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2016）11-0457-03
菌糠是培育食用菌后所剩的糠类物质，含有丰富的纤维素、粗蛋白等营养物质。随着我国对食用菌需求量的加大，菌糠的产量也大大增加，菌糠资源的二次利用以及环境保护等方面面临极大的挑战[1-2]。近年来的大量研究表明，利用微生物发酵菌糠可以制成微生物制剂及饲料，纤维素、木质素等被不同程度地降解，粗蛋白、粗脂肪均高于未经发酵的基质，可以缓解资源的浪费[3]。另外，将菌糠制备成益生菌制剂用于动物饲养，不仅有利于动物的消化吸收，而且降低了饲料成本[4-5]。
以往研究中的发酵菌糠所用菌株多为保藏菌种，关于菌糠中菌种利用的报道很少。本试验从菌糠中筛选出1株产纤维素酶能力强的菌株S-4，该菌株产生的纤维素酶可以更好地利用菌糠中的纤维素，降低纤维素含量。经生理生化、16S rRNA序列对比及分析鉴定，菌株S-4为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），羧甲基纤维素酶（carboxymethyl cellulase enzyme，CMCase）活力为67.5 U/ml。采用软件Design-Expert 8.0的Plackett-Burman试验筛选出对响应值影响较大的3个因素，利用最陡爬坡试验逼近最大响应区域，用Box-Behnken试验进一步优化得到最大响应值及最优增殖条件。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品 菌糠样品由河北农业大学动物科技学院提供。
1.1.2 试剂 羧甲基纤维素钠（简称CMC-Na）、酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏均由北京奥博星有限公司提供。MgSO4·7H2O、K2HPO4、KH2PO4、葡萄糖由天津福晨化学试剂厂提供。
1.1.3 培养基 牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、加水补足至1 000 mL，pH值7.0～8.0，121 ℃ 灭菌20 min，备用；发酵产酶培养基：CMC-Na 10 g、KH2PO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、酵母粉5 g，加水补足至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min，备用。刚果红筛选培养基：CMC-Na 2 g、（NH4）2SO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 1 g、NaCl 0.5 g、刚果红0.4 g、琼脂20 g，加水补足至1 000 mL，pH值7.0，121 ℃灭菌30 min。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株筛选
1.2.1.1 富集培养 菌糠中添加2%糖蜜、1%硫酸铵、60%水，于30 ℃恒温培养箱中培养48 h。将发酵后的菌糠按 1 ∶9 的比例置于生理盐水中，静置30 min，5 000 r/min离心 5 min，将离心后得到的菌悬液进行梯度稀释，涂布后于30 ℃恒温培养箱倒置培养48 h。
1.2.1.2 产纤维素酶菌株初筛 将培养后的菌糠按1 ∶9的比例溶于生理盐水中，5 000 r/min离心5 min，将离心后得到的菌悬液进行梯度稀释，并涂布于刚果红筛选培养基上，37 ℃ 培养24 h后放置2 d，测量透明圈直径与菌落直径，挑选出透明圈直径与菌落直径比值（简称圈菌比）较大的作为初筛菌株[6-7]，在刚果红初筛平板上进行划线分离纯化，并于斜面保存菌种。
1.2.1.3 产纤维素酶菌株复筛 将初筛得到的菌株接种到产酶培养基中，于37 ℃、160 r/min培养48 h，后于4 ℃、5 000 r/min 离心10 min，测定上清液的羧甲基纤维素酶活性[8]。
1.2.2 菌株鉴定
1.2.2.1 形态学特征及生理生化鉴定 观察菌株的菌落形态，革兰氏染色后观察菌株显微形态。利用细菌微量生化鉴定管进行生理生化鉴定[9]。
1.2.2.2 菌株的基因鉴定 提取菌株的基因组，并对基因组进行扩增，采用试剂盒割胶回收之后连接片段，进行热转化，对基因片段进行PCR扩增。扩增引物的合成以及测序工作由华大基因完成。得到16S序列后，在NCBI系统通过Blast进行序列比对分析，利用Mega 5.0软件的邻接法创建系统发育树[10-12]。
1.2.3 响应面法优化菌株S-4发酵条件 通过Plackett-Burman（PB）试验设计，从7个试验因素中筛选出3个显著影响因子[13-14]，利用最陡爬坡试验，使因素水平值逼近最大响应区域，结合响应面法BB试验设计进一步研究，并利用Design Expert软件进行回归分析[15-16]，寻求最佳水平，得到最优发酵条件[17]。
2 结果与分析
2.1 菌糠筛菌
由表1可知，圈菌比最大的菌株S-4为产纤维素酶能力最强的菌株。
摇瓶发酵复筛结果显示，菌株S-1、S-4的CMC活性分别为22.4、67.5 U/mL（表2）。综合圈菌比和CMC活性可知，S-4为目的菌株。 2.2 菌株S-4的鉴定
2.2.1 形态学特征及生理生化鉴定 形态观察表明，菌株 S-4 菌落形态为圆形，边缘不整齐，表面褶皱，干燥不透明，白色；液体培养形成菌膜，分层明显；经过染色后，油镜下观察到菌体形态为杆状，单个排列，革兰氏染色阳性，有芽孢。表3为菌株S-4的生理生化鑒定结果。
2.2.2 菌株的分子鉴定 提取菌株S-4的基因，进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖电泳。S-4菌株16S rRNA序列的扩增产物约为1 500 bp。序列信息在NCBI进行Blast比对，S-4菌株16S rRNA序列与枯草芽孢杆菌的16S rRNA序列同源性为97%。从系统进化发育树分析可知，菌株S-4与枯草芽孢杆菌的16S rRNA序列相似度最高（图1）。结合序列对比分析，初步判断菌株S-4为枯草芽孢杆菌。
2.3 响应面法优化菌株S-4发酵条件
2.3.1 PB试验 以枯草芽孢杆菌S-4为试验菌株，以菌悬液D546 nm为响应值，于37 ℃、160 r/min摇床发酵，分析影响发酵的7个因素：A，葡萄糖；B，酵母粉；C，KH2PO4；D，K2HPO4；E，MgSO4；F，蛋白胨；G，牛肉膏。由表4可见，该模型相关性极显著（P值=0.000 1<0.01），在90%的置信区间内，对于活菌量影响显著的3个因素依次为A：葡萄糖，F：蛋白胨，C：KH2PO4，以此作进一步的响应面分析。
2.3.2 最陡爬坡试验 根据一阶方程，确定其变化的步长以及方向，试验组合设计及结果见表5，可见第2组的Y值（D546 nm），即发酵后菌液中菌种生物含量最高。因此， 将葡萄糖含量12 g/L、蛋白胨含量6 g/L、KH2PO4含量0.4 g/L作为后续响应面Box-Behnken试验的中心点。
2.3.3 响应面Box-Behnken试验 在本研究的条件和方法的基础上，将A（葡萄糖12 g/L）、B（蛋白胨6 g/L）、C（KH2PO4 0.4 g/L）作为Box-Behnken试验的中心点，采用Design Expert 8.0软件对Box-Behnken试验结果进行方差分析和二次多项拟合。由表6可知，模型的P值=0.000 4，此模型高度显著，可信度高。A、C、AB、BC、A2、B2、C2对响应值都有显著影响，表明3个因素对响应值不是简单的线性关系。另外模型的R2=0.966 2，校正R2=0.913 7，说明该模型可以很好地模拟和验证试验的结果。变异系数为1.77%，置信度比较高，说明模型可以反映真实的试验值。
2.3.4 响应面分析 采用响应面法分析研究培养基成分，将PB试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验结合。结果显示，当3个显著因子分别为葡萄糖含量为13.08 g/L、蛋白胨含量为6.52 g/L、KH2PO4含量为0.37 g/L时，优化后活菌量比初始培养提高了34.49%。由图2、图3、图4可知，AB、BC之间具有十分明显的交互作用，AC之间的交互作用较小。为了验证结果的可靠性，保证发酵条件一致，分别于基础培养基、优化后的培养基中对菌株S-4进行试验，每组3个平行，并取平均值，得到优化后的D546 nm为3.478±0.034，与响应面分析预测结果拟合良好，基础培养基D546 nm为2.586±0.026，优化后的D546 nm比初始培养的提高了34.49%。
3 讨论与结论
通过对菌糠样品富集培养，利用纤维素筛选平板初筛、摇瓶发酵复筛，得到1株高产纤维素酶的菌株S-4。经过生理生化鉴定，并结合16S rRNA序列对比分析，鉴定为枯草芽孢杆菌，CMC活性为67.5 U/mL。采用响应面法分析培养基成分得出，当3个显著因子分别为葡萄糖含量 13.08 g/L、蛋白胨含量6.52 g/L、KH2PO4含量0.37 g/L时，优化后活菌量比初始培养提高了34.49%。枯草芽孢杆菌为饲用益生菌，且高产纤维素酶，用它来发酵菌糠，不仅可以降低粗纤维的含量，还能提高蛋白含量。枯草芽孢杆菌也可以提高动物肠道内的消化利用率[18-19]。响应面法优化增殖培养条件，试验次数少，周期较短，且对影响试验的各个因素进行分析总结，分析显著影响因子之间的交互作用，是一种高效优化发酵条件的途径[20-22]。
参考文献：
[1]张 昂. 菌糠的营养价值及其在畜禽生产中的应用[J]. 畜牧与饲料学，2014，35（7/8）：46-47.
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