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摘要：对大孔树脂纯化苦皮藤（Celastrus angulatus）种素C的最佳工艺进行了研究。比较了大孔吸附树脂HP20、AB-8、SP825、D101对苦皮藤种素C的吸附率、解吸率，选择性能较好的HP20树脂进行研究。以苦皮藤种素C的含量、浸膏得率为指标，考察了上样量、洗脱剂浓度、洗脱剂用量等因素对HP20大孔吸附树脂分离纯化苦皮藤种素C效果的影响，确定了较优工艺参数。优化工艺为：按HP20树脂与药材质量比为1 ∶3.0上样，用40倍柱体积的40%乙醇、90倍柱体积的60%乙醇依次洗脱。纯化后，样品中苦皮藤种素C含量提高7倍多。此方法简单可行，能较好地纯化苦皮藤种素C。
关键词：苦皮藤种素C；HP20大孔树脂；纯化；HPLC
中图分类号： O657.7 2 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0246-02
苦皮藤（Celastrus angulatus）为卫矛科南蛇藤属植物，别称苦树皮、马断肠等，广泛分布于陕西省、河南省、湖北省等地[1]。苦皮藤的根、茎、叶、果实、种子是天然的杀虫剂，同时也是重要的中药资源，民间用其根皮、茎皮、树叶防治蔬菜及各种作物虫害已有相当长的历史[2]。研究表明，苦皮藤种子中所含的主要杀虫活性成分为4-H-β-二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物，其中苦皮藤种素C（angulateoid C）是杀虫活性成分之一[3-4]，其结构如图1所示。
[FK（W9][TPWMJ1.tif]
苦皮藤种油对黄守瓜、菜粉蝶等多种害虫具有拒食作用，对赤拟谷盗等储粮害虫有较强的忌避作用，对玉米象有明显的致死、杀卵作用。大孔吸附树脂的比表面积较大，吸附性能良好，经不同极性的洗脱剂洗脱可以达到分离纯化化合物的目的，具有设备简单、操作方便、易于再生、产品纯度高等优点，特别适合天然产物的分离纯化[5-8]。本研究采用大孔树脂法分离纯化苦皮藤种素C，旨在为开发利用苦皮藤资源提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与材料
LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；Sunfire C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，0.5 μm）；CP214型分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；SHA-C型水浴恒温振荡器（常州冠军仪器制造有限公司）；HP20型大孔树脂、SP825型大孔树脂均购自日本三菱化学公司；AB-8型大孔树脂、D101型大孔树脂均购自天津市光复精细化工研究所；甲醇，色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司）；乙醇，医用纯（新乡市三伟消毒制剂有限公司）。
苦皮藤种素C标准品（笔者所在实验室自制）；苦皮藤种子采自湖北省恩施土家族苗族自治州，经河南农业大学朱长山教授鉴定。
1.2 方法
1.2.1 HPLC色谱条件
采用高效液相色谱法检测苦皮藤种素C含量，色谱流动相：甲醇-水（80 ∶20）；检测波长：232 nm；柱温：25 ℃；流速：2.0 mL/min；进样量：10 μL。
1.2.2 标准品溶液的制备
精密称取苦皮藤种素C标准品10.0 mg，用甲醇定容至50 mL，摇匀后得苦皮藤种素C标准品溶液。
1.2.3 标准曲线绘制
精密量取上述标准品溶液0.05、0.50、1.00、2.50、5.00 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。分别取以上溶液及标准品溶液10 μL注入液相色谱仪中，在波长232 nm处测定峰面积。以溶液浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，得回归方程：y=12 377x-5 305.5，r=0.999 9，线性范围为1～200 μg/mL，检出限为05 μg/mL（S/N=3），平均加样回收率为105.8%，RSD为1.31%。
1.2.4 上样液制备 称取苦皮藤种子2 500 g，粉碎，于 80 ℃ 水浴中以石油醚为溶剂回流提取3次，3次所加石油醚的体积分别是种子质量的3、2、2倍，抽滤、合并滤液，60 ℃ 下减压浓缩，除去溶剂得苦皮藤种油834.5 g。
2 结果与分析
以苦皮藤种素C的含量、浸膏得率为指标，对大孔树脂分离纯化苦皮藤种素C的工艺条件进行优化。考察上样量、洗脱剂浓度、洗脱剂用量等因素对HP20大孔吸附树脂分离纯化苦皮藤种素C效果的影响。
2.1 大孔树脂型号的选择
取6.0 g上样液，用甲醇定容至100 mL，HPLC分析苦皮藤种素C的浓度。取预处理过的HP20、AB-8、SP825、D101树脂各5.0 g置于锥形瓶中，各加入6.0 g上样液，在20 ℃恒温振荡器中充分振荡，吸附平衡后，过滤、减压蒸干，用甲醇定容至100 mL，HPLC分析苦皮藤种素C浓度。在达到吸附平衡的树脂中加入50 mL 95%乙醇，在20 ℃恒温振荡器中充分振荡，进行解吸。达到解吸平衡后，过滤，用30 mL 95%乙醇洗涤，合并洗涤液、滤液，减压蒸干，用甲醇定容至100 mL，HPLC分析苦皮藤种素C浓度，结果见表1。吸附率（q）及解吸率（E）计算公式如下：
结果表明，HP20型大孔吸附树脂对苦皮藤种素C具有较好的吸附作用且容易被洗脱，故选用HP20型大孔树脂进行研究。
2.2 最佳上样量
取4份预处理好的HP20型大孔树脂各50.0 g装柱，分别按树脂与药材质量比为1 ∶1.8、1 ∶3.0、1 ∶4.2、1 ∶5.4比例上样。在洗脱速度相同的条件下，先用40倍柱体积40%乙醇洗脱，除去部分杂质，再用90倍柱体积 60%乙醇洗脱，并将60%乙醇洗脱液减压蒸干，HPLC分析苦皮藤种素C含量。以苦皮藤种素C含量、浸膏得率为考察指标，确定最佳上样量，结果见表2。
3 结论与讨论
本研究表明，HP20大孔树脂分离纯化苦皮藤种素C的最佳工艺为：按树脂与药材质量比为1 ∶3.0上样，先用40倍柱体积40%的乙醇洗脱，再用90倍柱体积60%的乙醇洗脱。苦皮藤种素C为苦皮藤种子的主要活性成分，因此分离纯化苦皮藤种子中的苦皮藤种素C具有重要意义。采用HP20大孔树脂分离纯化苦皮藤种素C方法简单可行，能较好地纯化苦皮藤种素C，可作为工业上富集纯化苦皮藤种素C的一种方法。
参考文献：
[1]中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志：第45卷第3分册[M]. 北京：科学出版社，1999：102.
[2]柯治国，南玉生，卢令娴. 植源昆虫拒食剂苦皮藤的研究进展[J]. 武汉植物学研究，1993，11（3）：265-271.
[3]Cheng C Q，Wu D G，Liu J K . Angulatueoids A-D，four sesquiterpenes from the seeds of celastrus angulatus[J]. Phytochemistry，1992，31（8）：2777-2780.
[4]王国亮，南 蓬，龚复俊，等. 新倍半萜酯——苦皮藤酯1的结构鉴定[J]. 科学通报，1990（15）：1156-1158.
[5]徐 耀.不同型號大孔吸附树脂对草珊瑚黄酮的富集作用[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：262-265.
[6]张 旭，王锦玉，仝 燕，等. 大孔树脂技术在中药提取纯化中的应用及展望[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（6）：286-290.
[7]孙 健，岳瑞雪，钮福祥，等. 紫甘薯花青素的大孔树脂动态吸附工艺优化[J]. 江苏农业科学，2013，41（6）：227-229.
[8]李 华，赵振贵，李 丹，等. 大孔树脂对大豆异黄酮的吸附性能研究[J]. 郑州大学学报：工学版，2011，32（2）：19-22.
关键词：苦皮藤种素C；HP20大孔树脂；纯化；HPLC
中图分类号： O657.7 2 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0246-02
苦皮藤（Celastrus angulatus）为卫矛科南蛇藤属植物，别称苦树皮、马断肠等，广泛分布于陕西省、河南省、湖北省等地[1]。苦皮藤的根、茎、叶、果实、种子是天然的杀虫剂，同时也是重要的中药资源，民间用其根皮、茎皮、树叶防治蔬菜及各种作物虫害已有相当长的历史[2]。研究表明，苦皮藤种子中所含的主要杀虫活性成分为4-H-β-二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物，其中苦皮藤种素C（angulateoid C）是杀虫活性成分之一[3-4]，其结构如图1所示。
[FK（W9][TPWMJ1.tif]
苦皮藤种油对黄守瓜、菜粉蝶等多种害虫具有拒食作用，对赤拟谷盗等储粮害虫有较强的忌避作用，对玉米象有明显的致死、杀卵作用。大孔吸附树脂的比表面积较大，吸附性能良好，经不同极性的洗脱剂洗脱可以达到分离纯化化合物的目的，具有设备简单、操作方便、易于再生、产品纯度高等优点，特别适合天然产物的分离纯化[5-8]。本研究采用大孔树脂法分离纯化苦皮藤种素C，旨在为开发利用苦皮藤资源提供依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与材料
LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；Sunfire C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，0.5 μm）；CP214型分析天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；SHA-C型水浴恒温振荡器（常州冠军仪器制造有限公司）；HP20型大孔树脂、SP825型大孔树脂均购自日本三菱化学公司；AB-8型大孔树脂、D101型大孔树脂均购自天津市光复精细化工研究所；甲醇，色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司）；乙醇，医用纯（新乡市三伟消毒制剂有限公司）。
苦皮藤种素C标准品（笔者所在实验室自制）；苦皮藤种子采自湖北省恩施土家族苗族自治州，经河南农业大学朱长山教授鉴定。
1.2 方法
1.2.1 HPLC色谱条件
采用高效液相色谱法检测苦皮藤种素C含量，色谱流动相：甲醇-水（80 ∶20）；检测波长：232 nm；柱温：25 ℃；流速：2.0 mL/min；进样量：10 μL。
1.2.2 标准品溶液的制备
精密称取苦皮藤种素C标准品10.0 mg，用甲醇定容至50 mL，摇匀后得苦皮藤种素C标准品溶液。
1.2.3 标准曲线绘制
精密量取上述标准品溶液0.05、0.50、1.00、2.50、5.00 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。分别取以上溶液及标准品溶液10 μL注入液相色谱仪中，在波长232 nm处测定峰面积。以溶液浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，得回归方程：y=12 377x-5 305.5，r=0.999 9，线性范围为1～200 μg/mL，检出限为05 μg/mL（S/N=3），平均加样回收率为105.8%，RSD为1.31%。
1.2.4 上样液制备 称取苦皮藤种子2 500 g，粉碎，于 80 ℃ 水浴中以石油醚为溶剂回流提取3次，3次所加石油醚的体积分别是种子质量的3、2、2倍，抽滤、合并滤液，60 ℃ 下减压浓缩，除去溶剂得苦皮藤种油834.5 g。
2 结果与分析
以苦皮藤种素C的含量、浸膏得率为指标，对大孔树脂分离纯化苦皮藤种素C的工艺条件进行优化。考察上样量、洗脱剂浓度、洗脱剂用量等因素对HP20大孔吸附树脂分离纯化苦皮藤种素C效果的影响。
2.1 大孔树脂型号的选择
取6.0 g上样液，用甲醇定容至100 mL，HPLC分析苦皮藤种素C的浓度。取预处理过的HP20、AB-8、SP825、D101树脂各5.0 g置于锥形瓶中，各加入6.0 g上样液，在20 ℃恒温振荡器中充分振荡，吸附平衡后，过滤、减压蒸干，用甲醇定容至100 mL，HPLC分析苦皮藤种素C浓度。在达到吸附平衡的树脂中加入50 mL 95%乙醇，在20 ℃恒温振荡器中充分振荡，进行解吸。达到解吸平衡后，过滤，用30 mL 95%乙醇洗涤，合并洗涤液、滤液，减压蒸干，用甲醇定容至100 mL，HPLC分析苦皮藤种素C浓度，结果见表1。吸附率（q）及解吸率（E）计算公式如下：
结果表明，HP20型大孔吸附树脂对苦皮藤种素C具有较好的吸附作用且容易被洗脱，故选用HP20型大孔树脂进行研究。
2.2 最佳上样量
取4份预处理好的HP20型大孔树脂各50.0 g装柱，分别按树脂与药材质量比为1 ∶1.8、1 ∶3.0、1 ∶4.2、1 ∶5.4比例上样。在洗脱速度相同的条件下，先用40倍柱体积40%乙醇洗脱，除去部分杂质，再用90倍柱体积 60%乙醇洗脱，并将60%乙醇洗脱液减压蒸干，HPLC分析苦皮藤种素C含量。以苦皮藤种素C含量、浸膏得率为考察指标，确定最佳上样量，结果见表2。
3 结论与讨论
本研究表明，HP20大孔树脂分离纯化苦皮藤种素C的最佳工艺为：按树脂与药材质量比为1 ∶3.0上样，先用40倍柱体积40%的乙醇洗脱，再用90倍柱体积60%的乙醇洗脱。苦皮藤种素C为苦皮藤种子的主要活性成分，因此分离纯化苦皮藤种子中的苦皮藤种素C具有重要意义。采用HP20大孔树脂分离纯化苦皮藤种素C方法简单可行，能较好地纯化苦皮藤种素C，可作为工业上富集纯化苦皮藤种素C的一种方法。
参考文献：
[1]中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志：第45卷第3分册[M]. 北京：科学出版社，1999：102.
[2]柯治国，南玉生，卢令娴. 植源昆虫拒食剂苦皮藤的研究进展[J]. 武汉植物学研究，1993，11（3）：265-271.
[3]Cheng C Q，Wu D G，Liu J K . Angulatueoids A-D，four sesquiterpenes from the seeds of celastrus angulatus[J]. Phytochemistry，1992，31（8）：2777-2780.
[4]王国亮，南 蓬，龚复俊，等. 新倍半萜酯——苦皮藤酯1的结构鉴定[J]. 科学通报，1990（15）：1156-1158.
[5]徐 耀.不同型號大孔吸附树脂对草珊瑚黄酮的富集作用[J]. 江苏农业科学，2013，41（5）：262-265.
[6]张 旭，王锦玉，仝 燕，等. 大孔树脂技术在中药提取纯化中的应用及展望[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（6）：286-290.
[7]孙 健，岳瑞雪，钮福祥，等. 紫甘薯花青素的大孔树脂动态吸附工艺优化[J]. 江苏农业科学，2013，41（6）：227-229.
[8]李 华，赵振贵，李 丹，等. 大孔树脂对大豆异黄酮的吸附性能研究[J]. 郑州大学学报：工学版，2011，32（2）：19-22.