【摘 要】
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目的探讨纤维介素蛋白(fg12)的双链RNA(dsRNA)在体外对fg12凝血酶原酶基因表达的干扰作用及其规律.方法构建能产生鼠fg12(mfg12)的发夹状双链RNA(shRNA)的载体p-mfg12shRNA,
【机 构】
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湖北十堰郧阳医学院附属东风医院消化内科,武汉
【基金项目】
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湖北省武汉市科技攻关项目;国家重点基础研究发展计划(973计划)
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目的探讨纤维介素蛋白(fg12)的双链RNA(dsRNA)在体外对fg12凝血酶原酶基因表达的干扰作用及其规律.方法构建能产生鼠fg12(mfg12)的发夹状双链RNA(shRNA)的载体p-mfg12shRNA,将其与mfg12-EGFP融合基因表达质粒pEGFP-mfg12共转染(用量比为1:5)到中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)作为实验组,另仅转染pEGFP-mfg12或共转染无关序列shRNA表达质粒和pEGFP-mfg12(用量比为1:5)作为对照组.转染24、48、72 h后,观察mfg12-EGFP融合蛋白在CHO细胞中的表达情况,并通过流式细胞仪检测荧光细胞阳性率.分别将p-mfg12shRNA和mfg12cDNA表达质粒pcDNA3.1-mfg12共转染(用量比为1:5)到CHO细胞和人宫颈癌细胞(Hela细胞),作为试验组,另转染pcDNA3.1-mfg12或共转染无关序列shRNA表达质粒和pcDNA3.1-mfg12(用量比为1:5)或不转染任何质粒作为对照组.通过逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学检测mfg12在CHO和Hela这两种细胞株中表达的情况.结果实验组较对照组的绿色荧光强度明显减弱,荧光细胞数明显减少.在CHO和Hela两种细胞株,均显示mfg12shRNA显著抑制mfg12 mRNA和蛋白质的表达.结论本研究所构建的mfg12shRNA表达质粒p-mfg12shRNA可在体外高效特异地抑制mfg12的表达,为进一步的体内实验奠定了基础.
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