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摘要：从毛白杨中克隆得到木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶PtoXTH35基因，根据SignalIP在线软件预测蛋白信号肽，并分别构建至pET28a、pET32a、pGEX-4t-1、pMAL-c5e、pET 43.1a等5种原核表达载体，经双酶切和测序验证后转化至BL21（DE3）感受态，使用终浓度为0.4 mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导其表达目的蛋白。经SDS-PAGE检测，结果表明5种载体均可表达目的蛋白，pET28a、pET32a、pGEX-4t-1等3种载体所表达蛋白均以包涵体的形式存在，而pMAL-c5e和pET 43.1a载体携带蛋白表达量高并且所表达蛋白50%为可溶性蛋白，实现了毛白杨PtoXTH35在原核表达系统中的高效可溶性表达，该试验为后续进一步研究毛白杨PtoXTH35的体外功能奠定了基础。
关键词：毛白杨;木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶;原核表达;包涵体;可溶性蛋白
中图分类号： S792.117.01文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2019）08-0033-04
在植物的生长发育以及抵御生物和非生物胁迫过程中，细胞壁发挥着不可忽视的作用。在双子叶植物的初生细胞壁中，木葡聚糖以非共价键的形式与纤维素相连，从而形成了初生细胞壁当中主要的张力承载结构，木葡聚糖水解酶（xyloglucan endohydrolase，XEH）可以快速催化木葡聚糖的水解从而实现细胞壁的膨胀[1]。Albersheim等做出假设认为在植物细胞生长过程中还存在一种糖苷内部转移酶，将多糖链的一部分转移至自身的其他位置[2]。随后Fry等率先发现了一种蛋白可以在快速生长的植物细胞当中催化木葡聚糖链的断裂以及重连，并命名为木葡聚糖内转糖苷酶（xyloglucan endotransglycosylase，XET）[3]，XET和XEH共同组成了木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase，XTH）家族，被认为是一种细胞壁松弛酶，在植物生长过程中以及抵御外界胁迫过程中参与了细胞壁重构。XTH是一类庞大的多基因家族，属于碳水化合物活性酶家族数据库（CAZy）中的糖苷水解家族GH16。在毛果杨、拟南芥中已经发现了该基因家族中分别含有41、33个成员[4]，根据XTH蛋白编码的氨基酸序列以及蛋白质的结构可以将它们分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3类，其中Ⅰ和Ⅱ类具有糖基转移酶活性，Ⅲ类具有糖苷水解酶活性[5]。
目前对于XTH的研究主要集中在对该基因家族成员的功能鉴定及其在植物生长发育和抵御外界胁迫过程中发挥作用的机制，而要对基因家族中的成员进行体外功能验证则必须要实现蛋白的体外可溶性表达。目前文献中多采用酵母表达方法获得XTH可溶性蛋白，只有极少数文献报道通过原核表达以及包涵体变复性的方法获得可溶性蛋白，这可能是受限于XTH在原核系统中多以包涵体的形式表达[6-10]。因此，本研究拟通过更换携带有不同可溶性标签的载体以实现毛白杨PtoXTH35（Populus tomentosa xyloglucan endotransgl-ycosylase/hydrolase 35）蛋白在原核中的高效可溶性表达，以期为后续功能验证等相关试验奠定基础。
1材料与方法
试验于2016年10月至2017年3月在北京市海淀区北京林业大学进行。
1.1质粒和菌株
pET28a、pET32a、pGEX-4t-1、pMAL-c5e、pET 43.1a质粒载体以及大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3）、JM109菌株均由笔者所在实验室保留。
1.2试剂
胰蛋白胨、酵母粉均购自Oxiod公司;Taq酶、T4连接酶、限制性内切酶、2 ku DNA Maker、10 ku DNA Maker，均购自宝生物工程（大连）有限公司;蛋白质分子量标准，购自中国科学院上海生物化学研究所;其他化学试剂均购自北京蓝弋化工产品有限责任公司。
1.3主要仪器
POWER PAC 300电泳仪（美国BIO-RED公司），Universal Hood Ⅱ型凝胶成像仪（美国BIO-RED公司），ABI Veriti FAST 梯度PCR仪（美国Applied Biosystems公司），DNA Engine连接仪（美国BIO-RED公司），SHK-02-Ⅰ台式空气恒温摇床（北京北方同正生物技术发展有限公司），JY92-Ⅱ型超聲波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）。
1.4试验方法
1.4.1毛白杨PtoXTH35基因克隆与序列分析
通过在NCBI上查找得到毛果杨PtrXTH35基因序列信息，利用DNAMAN设计正向引物5′-ATGGCTGTTTCAGTCTTTAAG-3′和反向引物5′-CTAGTGGTGGCGGTGGCT-3′。以毛白杨的cDNA为模板进行PCR扩增，反应程序为95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃ 10 min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并利用DNA纯化回收试剂盒进行胶回收并送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序，将测序所得序列与毛果杨PtrXTH35序列进行比对。
1.4.2原核表达载体的构建
利用DNAMAN将测序得到的PtoXTH35的DNA序列翻译为氨基酸序列并上传至SignalIP和TMHMM 2.0在线软件分析信号肽序列和跨膜区，以去除信号肽的序列为模板设计引物，利用PCR方法为目的基因两端加上酶切位点，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后用相应的限制性内切酶进行酶切并回收目的片段，同时用相应的限制性内切酶对质粒载体pET28a、pET32a、pGEX-4t-1、pMAL-c5e、pET 43.1a进行酶切回收，之后将酶切的载体和目的片段利用T4连接酶连接，将连接液经CaCl2法转化至JM109感受态，待长出单克隆后摇菌提取质粒进行酶切鉴定。载体构建引物及酶切位点如表1所示。 1.4.3PtoXTH35蛋白原核表达
将构建好的载体pET28a-PtoXTH35、pET32a-PtoXTH35、pGEX-4t1-PtoXTH35、pMAL-c5e-PtoXTH35、pET 43.1a-PtoXTH35转化至E. coli BL21（DE3）感受态并用抗生素筛选阳性菌株，挑取阳性单克隆接种于5 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min 振荡培养12 h，之后将5 mL菌液接种于 100 mL 含相应抗生素的LB培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养至 D600 nm=0.4左右，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4 mmol/L。 28 ℃诱导表达4 h，6 000 r/min 离心10 min收集菌体，加入4倍体积50 mmol/L Tris-HCl（pH值为8.0）缓冲液重悬，经超声破碎后 12 000 r/min 离心，取上清和沉淀加入等体积蛋白上样缓冲液，沸水中煮5 min后离心取上清，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定蛋白表达。
2结果与分析
2.1毛白杨PtoXTH35基因克隆与序列分析
经PCR扩增得到如图1所示的DNA片段，测序获得毛白杨PtoXTH35核酸序列，与毛果杨PtrXTH35序列比对相似度高达98.32%（图2），证实该序列为毛白杨PtoXTH35基因片段，该序列全长888 bp，由269个氨基酸组成，所翻译的蛋白质分子量为33.69 ku，经SignalIP和TMHMM 2.0在线软件分析该蛋白N端存在跨膜区可能为信号肽序列，且推测信号肽裂解位点位于第25和第26个氨基酸之间（图3、图4）。
2.2原核表达载体的构建
将5个载体的阳性质粒经双酶切进行验证，分别选用表码和突变，可以用于下一步的诱导表达。
2.3PtoXTH35蛋白的原核诱导表达
将5种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态，经0.4 mmol/L IPTG诱导培养4 h后收集菌体，取全菌以及经超声破碎后的沉淀和上清液煮沸后经12% SDA-PAGE檢测蛋白表达，由于5种原核表达载体均携带了分子量不同的可溶性蛋白标签，因此所表达的融合蛋白分子量并不相同，根据计算获得融合蛋白分子量的理论值，pET28a携带了1个 6×His标签，融合蛋白分子量约为32 ku;pET32a携带了1个19 ku的硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx），融合蛋白分子量约为51 ku;pGEX-4t-1携带了1个27 ku的谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione S transferase，GST），融合蛋白分子量约为 59 ku;pMAL-c5e携带了1个40 ku的麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein，MBP），融合蛋白分子量约为72 ku;pET 43.1a携带了1个60 ku的转录终止抗终止因子（N-utilization substance，Nus），融合蛋白分子量约为92 ku。结果表明，经IPTG诱导，携带5种重组载体的大肠杆菌均成功表达了融合蛋白，并且分子量与理论分子量相符合（图6）。但五种原核表达载体所表达蛋白的表达量以及可溶性表达情况并不相同，其中pET28a蛋白表达量最高，但蛋白几乎全部以包涵体形式存在;pGEX-4t-1和pET32a蛋白表达量较低，并且所表达蛋白同样以包涵体形式存在;而pMAL-c5e和pET 43.1a蛋白表达量较高，而可溶性蛋白含量与包涵体蛋白大致相同，因此可溶性蛋白达到了总表达蛋白的50%左右，实现了PtoXTH蛋白在原核表达系统中的高效可溶性表达。
3结论
XTH基因广泛存在于植物中，在植物细胞壁修饰中发挥重要作用，其庞大的基因家族中存在众多还未明确得到功能验证的成员，因此迫切需要对该家族中成员进行体外和体内功能验证，包括活性测定以及体外蛋白互作研究则须要获得可溶性的目的蛋白。现有报道XTH的原核表达往往会形成包涵体，大部分文献中采用酵母表达的方法获得XTH蛋白，但酵母表达方法耗时较长，并且纯化步骤较为繁琐，对表达条件也更为敏感，本研究更换了5种携带有不同可溶性标签的原核表达载体，通过尝试发现携带有MBP蛋白的pMAL-c5e和携带有Nus因子的pET 43.1a均可实现PtoXTH35蛋白在原核表达系统中的高效可溶性表达，与大部分文献中[6-9]通过酵母表达获得XTH蛋白的方法相比，缩短了试验周期，并且表达条件稳定，纯化步骤相较酵母表达也更为简单，这为后续深入研究毛白杨PtoXTH35的生物学功能奠定了基础。
参考文献：
[1]Rose J K，Braam J，Fry S C，et al. The XTH family of enzymes involved in xyloglucan endotransglucosylation and endohydrolysis：current perspectives and a new unifying nomenclature[J]. Plant
关键词：毛白杨;木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶;原核表达;包涵体;可溶性蛋白
中图分类号： S792.117.01文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2019）08-0033-04
在植物的生长发育以及抵御生物和非生物胁迫过程中，细胞壁发挥着不可忽视的作用。在双子叶植物的初生细胞壁中，木葡聚糖以非共价键的形式与纤维素相连，从而形成了初生细胞壁当中主要的张力承载结构，木葡聚糖水解酶（xyloglucan endohydrolase，XEH）可以快速催化木葡聚糖的水解从而实现细胞壁的膨胀[1]。Albersheim等做出假设认为在植物细胞生长过程中还存在一种糖苷内部转移酶，将多糖链的一部分转移至自身的其他位置[2]。随后Fry等率先发现了一种蛋白可以在快速生长的植物细胞当中催化木葡聚糖链的断裂以及重连，并命名为木葡聚糖内转糖苷酶（xyloglucan endotransglycosylase，XET）[3]，XET和XEH共同组成了木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase，XTH）家族，被认为是一种细胞壁松弛酶，在植物生长过程中以及抵御外界胁迫过程中参与了细胞壁重构。XTH是一类庞大的多基因家族，属于碳水化合物活性酶家族数据库（CAZy）中的糖苷水解家族GH16。在毛果杨、拟南芥中已经发现了该基因家族中分别含有41、33个成员[4]，根据XTH蛋白编码的氨基酸序列以及蛋白质的结构可以将它们分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3类，其中Ⅰ和Ⅱ类具有糖基转移酶活性，Ⅲ类具有糖苷水解酶活性[5]。
目前对于XTH的研究主要集中在对该基因家族成员的功能鉴定及其在植物生长发育和抵御外界胁迫过程中发挥作用的机制，而要对基因家族中的成员进行体外功能验证则必须要实现蛋白的体外可溶性表达。目前文献中多采用酵母表达方法获得XTH可溶性蛋白，只有极少数文献报道通过原核表达以及包涵体变复性的方法获得可溶性蛋白，这可能是受限于XTH在原核系统中多以包涵体的形式表达[6-10]。因此，本研究拟通过更换携带有不同可溶性标签的载体以实现毛白杨PtoXTH35（Populus tomentosa xyloglucan endotransgl-ycosylase/hydrolase 35）蛋白在原核中的高效可溶性表达，以期为后续功能验证等相关试验奠定基础。
1材料与方法
试验于2016年10月至2017年3月在北京市海淀区北京林业大学进行。
1.1质粒和菌株
pET28a、pET32a、pGEX-4t-1、pMAL-c5e、pET 43.1a质粒载体以及大肠杆菌（Escherichia coli） BL21（DE3）、JM109菌株均由笔者所在实验室保留。
1.2试剂
胰蛋白胨、酵母粉均购自Oxiod公司;Taq酶、T4连接酶、限制性内切酶、2 ku DNA Maker、10 ku DNA Maker，均购自宝生物工程（大连）有限公司;蛋白质分子量标准，购自中国科学院上海生物化学研究所;其他化学试剂均购自北京蓝弋化工产品有限责任公司。
1.3主要仪器
POWER PAC 300电泳仪（美国BIO-RED公司），Universal Hood Ⅱ型凝胶成像仪（美国BIO-RED公司），ABI Veriti FAST 梯度PCR仪（美国Applied Biosystems公司），DNA Engine连接仪（美国BIO-RED公司），SHK-02-Ⅰ台式空气恒温摇床（北京北方同正生物技术发展有限公司），JY92-Ⅱ型超聲波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）。
1.4试验方法
1.4.1毛白杨PtoXTH35基因克隆与序列分析
通过在NCBI上查找得到毛果杨PtrXTH35基因序列信息，利用DNAMAN设计正向引物5′-ATGGCTGTTTCAGTCTTTAAG-3′和反向引物5′-CTAGTGGTGGCGGTGGCT-3′。以毛白杨的cDNA为模板进行PCR扩增，反应程序为95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃ 10 min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并利用DNA纯化回收试剂盒进行胶回收并送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序，将测序所得序列与毛果杨PtrXTH35序列进行比对。
1.4.2原核表达载体的构建
利用DNAMAN将测序得到的PtoXTH35的DNA序列翻译为氨基酸序列并上传至SignalIP和TMHMM 2.0在线软件分析信号肽序列和跨膜区，以去除信号肽的序列为模板设计引物，利用PCR方法为目的基因两端加上酶切位点，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后用相应的限制性内切酶进行酶切并回收目的片段，同时用相应的限制性内切酶对质粒载体pET28a、pET32a、pGEX-4t-1、pMAL-c5e、pET 43.1a进行酶切回收，之后将酶切的载体和目的片段利用T4连接酶连接，将连接液经CaCl2法转化至JM109感受态，待长出单克隆后摇菌提取质粒进行酶切鉴定。载体构建引物及酶切位点如表1所示。 1.4.3PtoXTH35蛋白原核表达
将构建好的载体pET28a-PtoXTH35、pET32a-PtoXTH35、pGEX-4t1-PtoXTH35、pMAL-c5e-PtoXTH35、pET 43.1a-PtoXTH35转化至E. coli BL21（DE3）感受态并用抗生素筛选阳性菌株，挑取阳性单克隆接种于5 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min 振荡培养12 h，之后将5 mL菌液接种于 100 mL 含相应抗生素的LB培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养至 D600 nm=0.4左右，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4 mmol/L。 28 ℃诱导表达4 h，6 000 r/min 离心10 min收集菌体，加入4倍体积50 mmol/L Tris-HCl（pH值为8.0）缓冲液重悬，经超声破碎后 12 000 r/min 离心，取上清和沉淀加入等体积蛋白上样缓冲液，沸水中煮5 min后离心取上清，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定蛋白表达。
2结果与分析
2.1毛白杨PtoXTH35基因克隆与序列分析
经PCR扩增得到如图1所示的DNA片段，测序获得毛白杨PtoXTH35核酸序列，与毛果杨PtrXTH35序列比对相似度高达98.32%（图2），证实该序列为毛白杨PtoXTH35基因片段，该序列全长888 bp，由269个氨基酸组成，所翻译的蛋白质分子量为33.69 ku，经SignalIP和TMHMM 2.0在线软件分析该蛋白N端存在跨膜区可能为信号肽序列，且推测信号肽裂解位点位于第25和第26个氨基酸之间（图3、图4）。
2.2原核表达载体的构建
将5个载体的阳性质粒经双酶切进行验证，分别选用表码和突变，可以用于下一步的诱导表达。
2.3PtoXTH35蛋白的原核诱导表达
将5种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态，经0.4 mmol/L IPTG诱导培养4 h后收集菌体，取全菌以及经超声破碎后的沉淀和上清液煮沸后经12% SDA-PAGE檢测蛋白表达，由于5种原核表达载体均携带了分子量不同的可溶性蛋白标签，因此所表达的融合蛋白分子量并不相同，根据计算获得融合蛋白分子量的理论值，pET28a携带了1个 6×His标签，融合蛋白分子量约为32 ku;pET32a携带了1个19 ku的硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx），融合蛋白分子量约为51 ku;pGEX-4t-1携带了1个27 ku的谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione S transferase，GST），融合蛋白分子量约为 59 ku;pMAL-c5e携带了1个40 ku的麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein，MBP），融合蛋白分子量约为72 ku;pET 43.1a携带了1个60 ku的转录终止抗终止因子（N-utilization substance，Nus），融合蛋白分子量约为92 ku。结果表明，经IPTG诱导，携带5种重组载体的大肠杆菌均成功表达了融合蛋白，并且分子量与理论分子量相符合（图6）。但五种原核表达载体所表达蛋白的表达量以及可溶性表达情况并不相同，其中pET28a蛋白表达量最高，但蛋白几乎全部以包涵体形式存在;pGEX-4t-1和pET32a蛋白表达量较低，并且所表达蛋白同样以包涵体形式存在;而pMAL-c5e和pET 43.1a蛋白表达量较高，而可溶性蛋白含量与包涵体蛋白大致相同，因此可溶性蛋白达到了总表达蛋白的50%左右，实现了PtoXTH蛋白在原核表达系统中的高效可溶性表达。
3结论
XTH基因广泛存在于植物中，在植物细胞壁修饰中发挥重要作用，其庞大的基因家族中存在众多还未明确得到功能验证的成员，因此迫切需要对该家族中成员进行体外和体内功能验证，包括活性测定以及体外蛋白互作研究则须要获得可溶性的目的蛋白。现有报道XTH的原核表达往往会形成包涵体，大部分文献中采用酵母表达的方法获得XTH蛋白，但酵母表达方法耗时较长，并且纯化步骤较为繁琐，对表达条件也更为敏感，本研究更换了5种携带有不同可溶性标签的原核表达载体，通过尝试发现携带有MBP蛋白的pMAL-c5e和携带有Nus因子的pET 43.1a均可实现PtoXTH35蛋白在原核表达系统中的高效可溶性表达，与大部分文献中[6-9]通过酵母表达获得XTH蛋白的方法相比，缩短了试验周期，并且表达条件稳定，纯化步骤相较酵母表达也更为简单，这为后续深入研究毛白杨PtoXTH35的生物学功能奠定了基础。
参考文献：
[1]Rose J K，Braam J，Fry S C，et al. The XTH family of enzymes involved in xyloglucan endotransglucosylation and endohydrolysis：current perspectives and a new unifying nomenclature[J]. Plant