【摘 要】
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目的 研究不同引物组合和病毒载量对丙型肝炎病毒(HCV) RNA逆转录和NS5B区巢式PCR反应效率,以及由于逆转录引物不同对基因分型结果的影响. 方法 用荧光定量PCR检测病毒载量.
【机 构】
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广西壮族自治区疾病预防控制中心,广西病毒性肝炎防治研究重点实验室,广西南宁530028;柳州市柳铁中心医院,南方医科大学附属柳州医院,广西柳州545007
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目的 研究不同引物组合和病毒载量对丙型肝炎病毒(HCV) RNA逆转录和NS5B区巢式PCR反应效率,以及由于逆转录引物不同对基因分型结果的影响. 方法 用荧光定量PCR检测病毒载量.分别用Oligo(dT) 15和随机引物pd(N)6将HCV RNA逆转录合成cDNA,用针对5'-NTR区的巢式PCR进行检测;分别用针对NS5B区的简单引物和简并引物组合进行巢式PCR,比较各组扩增效率.对NS5B区第2轮PCR产物测序并比较基因分型结果的一致性. 结果 用Oligo(dT) 15引物逆转录和随机引物逆转录合成cDNA,5'-NTR区扩增的阳性率分别为87.5％和98.4％,差异有统计学意义(x2=17.6,P＜0.001).用HCV1/HCV2-122S/123A简单引物组合和ENO2/ENO4-NS5S3/NS5A5简并引物组合对Oligo(dT) 15逆转录cDNA产物进行NS5B区的巢式PCR扩增,阳性率分别为11.5％和35.4％,差异有统计学意义(x2=30.7,P＜0.001);用上述两组引物组合对随机引物逆转录cDNA进行NS5B区巢式PCR扩增,其阳性率分别为45.3％和94.3％,差异有统计学意义(x2=109.1,P＜0.001).随机引物在不同载量病毒组中的逆转录反应阳性率差异无统计学意义(x2 =2.00,P＞0.05);随机引物配合简并引物组合在不同载量病毒组NS5B区扩增的阳性率差异无统计学意义(x2 =5.18,P＞0.05).经Oligo(dT) 15引物和随机引物合成cDNA,用简并引物组合对NS5B区进行巢式PCR扩增,通过核酸测序确定HCV基因型完全一致. 结论 使用pd(N)6随机引物进行逆转录,结合ENO2/ENO4-NS5S3/NS5A5简并引物组合可实现对不同载量HCV的基于NS5B区的高效巢式PCR扩增和基因分型.
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