论文部分内容阅读
摘 要 为明确红棕象甲[Rhynchophorous ferrugineus（Oliver）]高龄幼虫冷驯化试验的有效降温速率范围，初步了解其体内抗寒物质应对不同降温条件下生理指标的变化。实验设定3种不同降温速率（1.00、0.10、0.05 ℃/min），①从（25±0.5）℃分别降至5 ℃进行冷驯化，后置于检测温度（-8 ℃）下处理2 h观察并统计存活率；②测定不同降温速率处理后试虫体内相关生理指标的变化，两组实验均设置空白对照组。结果表明：红棕象甲高龄幼虫冷驯化有效降温速率范围在1.00～0.10 ℃/min之间，最佳降温速率为0.10 ℃/min；试虫应对不同降温速率时，体内脂肪、甘油、总糖及血淋巴蛋白质含量均较空白组显著升高（p<0.05），而水含量较空白组显著降低（p<0.05）。
关键词 红棕象甲；高龄幼虫；降温速率；冷驯化
中图分类号 Q965 文献标识码 A
Definitude of Effective Cooling Rates of Cold Acclimation
for Old larvae of Red Palm Weevil Rhynchophorous
ferrugineus（Oliver）
WAN Jie1，2， YAN Wei2 *， LIU Li2， LONG Xuefeng2， LI Chaoxu2， QIN Weiquan2 *
1 Environment and Plant Protection Department， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
2 Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571339， China
Abstract To clarify the effective cooling rates used in the cold acclimation process and preliminarily understand changes of physiological indictors of old larva of Red Palm Weevil Rhynchophorous ferrugineus（Oliver） RPW exposed to different cooling condition. We set three kinds of cooling rates（1.00， 0.10， 0.05 ℃/min）and ①cooled the subjects from 25 ℃ to 5 ℃， respectively， then transferred to -8 ℃ for 2 h and recorded the survival； ②Determined the correspondingly physiological changes related to the insect cold hardness after the subjects were experienced the cold hardening process with different cooling rates. Both experiments were compared with the relative control groups. The results showed that the optimal cooling rate was 0.10 ℃/min for the subjects； Besides， the content of lipid， glycerol， total sugar， and proteins from hemolymph were significantly higher than those of control groups， whereas the content of water was significantly lower than that of control groups.
Key words Rhynchophorous ferrugineus（Oliver）； Old larvae； Cooling rate； Cold acclimation
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.026
昆虫在经历胁迫低温之上一个较温和的低温后，能够增强其抵抗低温冷伤害能力，即耐寒性的现象称为冷驯化[1-2]。根据冷驯化时间的长短，又可将其划分为快速冷驯化与长期冷驯化。相对于长期研究的越冬冷驯化，快速冷驯化现象是近年才发现并受到了研究者们的普遍重视[3]。降温速率作为影响昆虫快速冷驯化重要因子之一最早发现于家蝇蛹的研究中[4]。大量研究表明较慢的降温速率能显著提高昆虫耐寒性[5]，但得出此结论的试验对象多属双翅目、鳞翅目或膜翅目等[4-6]。对于鞘翅目昆虫，国外某些报道中指出：接近环境降温的较慢的降温速率并不能显著提高昆虫的耐寒性[7-9]。
红棕象甲[Rhynchophorous ferrugineus（Oliver）]属鞘翅目象甲科蛀干性害虫，主要以幼虫取食树干或树冠心叶危害棕榈科植物，一旦钻入树内，通常6～8个月就会造成树体死亡，在大面积种植棕榈植物的热带地区频繁发生灾害，被列为我国进出口检疫性害虫之一[10]。世代重叠，冬季危害较小，主要以高龄幼虫、蛹、成虫越冬[11]。中国广泛分布于广东、台湾、云南、西藏（墨脱）、广西、浙江、海南等地，现今已扩散至上海（30～32°N）[12]，约同纬度地区国外的日本鹿儿岛（>31°N）也见其报道[13]。红棕象甲是否存在继续向北扩散的趋势，是目前研究者们希望探讨的问题。因此，本实验设定3种不同降温速率，观察不同降温速率对红棕象甲高龄幼虫低温冷驯化效果，明确其冷驯化有效降温速率范围以及不同降温速率对试虫体内相应理化指标的影响等，旨在明确红棕象甲高龄幼虫应对不同低温胁迫时其生理上适应性调整，为预测其向北扩散的潜在区域并采取相应有效的防控措施提供理论基础。 1 材料与方法
1.1 材料
供试成虫采于海南省文昌市椰子大观园，使用信息素诱集方法抓获后[14]，将成虫带回实验室。雌雄配对后将其置于广口瓶，瓶内悬挂含8%～10% 蜂蜜水的棉球供成虫取食产卵。然后将广口瓶置于温度为（28±0.5）℃，相对湿度75%±5%，光照周期L ∶ D=14 ∶ 10的人工气候箱（型号：PYX-300Q-B，广州深华生物技术有限公司）中培养。成虫产下卵后将卵转移至干净的培养皿，将培养皿继续放置人工气候箱中直至孵化为1龄幼虫，1龄幼虫到高龄幼虫之间以人工饲料饲养[11]。对于幼虫的饲养条件，除光照周期调整为L ∶ D=0 ∶ 24，其他饲养条件与成虫设置的饲养条件一致。根据发育天数和头壳宽度及颜色判断虫龄，挑选发育天数为68 d的高龄幼虫作为试验对象，试虫均为野外种群在室内人工饲养的F1代。
1.2 方法
1.2.1 过冷却点的测定 采用热电偶方法进行测定[15]，仪器主要有高低温湿热箱（型号：GDJS-100，沈阳林频实验设备有限公司）和过冷却点测定仪（SUN-V型智能昆虫过冷却点测定仪）组成。试验重复3次，每次处理8头幼虫，记录过冷却点值。
1.2.2 检测温度的确定 对于大多数昆虫的快速冷驯化试验，检测方法沿用Chen等[16]最初研究麻蝇时提出的试验方案。由上一步确定的红棕象甲高龄幼虫过冷却点为-8.37 ℃。设计从0 ℃到-8.37 ℃之间一系列温度梯度，分别为：0、-2、-4、-6、-8 ℃，然后把高龄幼虫从正常的饲养温度直接转移到系列温度下处理2 h，然后再将其取出置于常温下恢复1 d后，观察并统计其存活率。以毛笔拨动虫体表，若试虫出现蠕动或缓慢爬行则视为存活；虫体发黑变硬且无明显肢体蠕动则视为死亡。选择存活率在15%～30%对应的温度作为检测温度。本实验设定红棕象甲高龄幼虫的检测温度为：-8 ℃下处理2 h。每次处理组选取8头幼虫，每个处理重复3次。
1.2.3 不同降温速率对红棕象甲高龄幼虫存活率的影响 挑选健康且大小均匀的高龄幼虫将其置于高低温湿热箱中（型号：LP/GDJS-100，沈阳林频），分别设定3种降温速率（1.00、0.10、0.05 ℃/min）从25 ℃降到5 ℃，然后将每组处理转移置检测温度-8 ℃下2 h后，取出置于室温下恢复1 d，观察并统计存活率。实验设置空白组，即将未经冷驯化处理的试虫直接转移置检测温度下处理2 h后取出，恢复1 d并统计其存活率。每组处理8头幼虫，每个处理重复3次。
1.2.4 不同降温速率对红棕象甲高龄幼虫体内生理指标的影响
（1）虫体含水量测定。挑选健康且大小均匀的高龄幼虫，用棉花将试虫体表清理干净并吸干水分后称取各幼虫样品鲜重，记为FM（fresh mass），然后将试虫置于60 ℃恒温培养箱中干燥3 d后取出，分别称量单头虫体干重记为DM（dry mass）。体内含水率/%=（FM-DM）/FM×100。每组处理8头幼虫，每个处理重复3次。
（2）虫体游离脂肪含量的测定。将试虫置于60 ℃烘干箱中烘干3 d后，取出并充分研磨，然后取一定量研磨液（体内油脂含量较高）M装入滤纸筒内，称重滤纸与研磨液总质量记为M1，将滤纸筒放入索氏提取器内，加入纯乙醚，在60 ℃加热回流提取5 h，然后将蒸馏瓶加热除去残余乙醚并干燥，取出干燥后的滤纸筒并称重记为M2。游离粗脂肪/%=（M2-M1）/M×100。每个处理8头试虫，每组处理重复3次。
（3）虫体甘油含量的测定。绘制标准曲线：分别在6支10 mL离心试管内注入15%的CuSO4溶液0.3 mL和5%的NaOH溶液3.5mL，配制Cu（OH）2悬浊液，再加入50%的甘油溶液和蒸馏水，使甘油的含量依次为40.0、45.0、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0 g/L，充分震荡，离心分离后取上清液分别置于比色皿中，在630 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线。虫体甘油含量测定：绘制标准曲线后取脂类提取液0.1 mL注入10 mL离心试管内，加浓H2SO4 2 mL，在沸水浴中消化，加入Cu（OH）2悬浊液，离心分离，取上清液用分光光度计测其吸光值，查标准曲线得虫体甘油含量[17]。每个处理8头试虫，每组处理重复3次
（4）虫体总糖含量测定。采用蒽酮法测定糖原含量[18]，取充分研磨的幼虫0.3 g，加1 mL 30% KOH，设置3次重复，沸水浴30 min左右，直到水解液清澈透明无颗粒为止。冷却后移入离心管，加入3 mL 95%乙醇。将离心管放在冰箱内过夜，次日离心（10 min，3 500 r/min）弃上清液，再将沉淀溶于1 mL蒸馏水中，并加入4 mL乙醇（95%），在冰箱内放置3～4 h，离心弃上清液，沉淀用蒸馏水溶解过滤并定容于25 mL容量瓶中即得样品待测液。每个处理8头试虫，每组处理重复3次
（5）血淋巴中蛋白质含量的测定。在1.5 mL离心管内加入苯基硫脲晶体数粒防止黑化，置冰浴上预冷，然后将试虫用蒸馏水冲洗净后用滤纸吸去体表水渍，然后用手揉捏试虫几下后捏紧虫体，用针孔刺破虫体表使血淋巴滴出，用40 μL移液枪直接收集血淋巴于预冷的离心管内，收集完后将其保存于-70 ℃冰箱待用。参照 Bradford[19]方法，配制1 mg/mL的BSA（牛血清白蛋白）标准蛋白液，并绘制标准曲线。血淋巴蛋白质测定时，先将血淋巴稀释10倍，取4 μL稀释液，加入蒸馏水补足至1 mL，加入3 mL考马斯亮蓝染色液，25 ℃保温15 min，于595 nm处测光吸收值，从标准曲线上求出血淋巴蛋白含量。每组处理8只试虫，每个处理重复3次。
1.3 数据分析
采用SPSS 15.0软件对试验数据进行统计分析，获取平均值及标准差，不同处理间差异进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncan多重比较。 2 结果与分析
2.1 红棕象甲高龄幼虫过冷却点测定
如表1所示，红棕象甲高龄幼虫过冷却点（Supercooling point）（SCP）差异较显著（p<0.05），平均值为（-8.58±2.6）℃；其中，最高值为-4.43 ℃，最低值为-13.78 ℃。
2.2 检测温度的确定
如图1所示，将红棕象甲高龄幼虫置于不同低温梯度下处理2 h后，其存活率随低温温度的降低而减少，直至暴露于-8 ℃下2 h，平均存活率为16.67%，因此选此温度作为检测温度。
2.3 不同降温速率对红棕象甲高龄幼虫存活率的影响
如图2所示，分别以1.00、0.10、0.05 ℃/min的降温速率冷驯化试虫后其存活率间差异显著（p<0.05），且0.10 ℃/min降温速率处理组的存活率与空白组间存活率差异极显著（p<0.01），冷驯化后试虫存活率平均值提高至45.83%，约为空白组存活率（16.67%）的2～3倍；另两处理组与空白组间差异不显著（p>0.05），依次为1.00 ℃/min（20.83%）和0.05 ℃/min（8.33%）；而以0.05 ℃/min降温速率处理后红棕象甲高龄幼虫的存活率却低于未经冷驯化处理对照组的存活率，可看出0.05 ℃/min的降温速率处理后并未增强其耐寒性，而是削弱了红棕象甲高龄幼虫的耐寒性。
2.4 红棕象甲高龄幼虫体内水分含量与存活率之间的关系
如图3所示，分别以3种降温速率冷驯化红棕象甲高龄幼虫后，处理组试虫体内含水量均低于空白组试虫的含水量，分别为68.02%（1.00 ℃/min）、62.67%（0.10 ℃/min）、67.42%（0.05 ℃/min）；其中以0.10 ℃/min处理组含水率与空白组含水率（71.12%）间差异极显著（p<0.01），且与其他二组间差异显著（p<0.05）；其他两组含水率均与空白组间含水率差异不显著（p>0.05）。
2.5 红棕象甲高龄幼虫体内游离脂肪含量与耐寒性的关系
由图4可知，红棕象甲高龄幼虫体内脂肪含量在不同降温速率1.00、0.10、0.05℃/min处理组间差异不显著（p>0.05），处理后脂肪含量分别为57.25%、52.62%、58.29%；但1.00 ℃/min与0.05 ℃/min降温速率处理后试虫体内脂肪含量均显著高于未经冷驯化的空白组试虫体内脂肪含量（42.76%）（p<0.05）；而0.10 ℃/min的降温速率处理后试虫体内脂肪含量较空白组含量高，但差异不显著（p>0.05）；1.00 ℃/min与0.05 ℃/min冷驯化后的虫体内脂肪含量较高，但二者之间差异不显著。
2.6 红棕象甲高龄幼虫体内甘油含量与耐寒性的关系
从图5可以看出，红棕象甲高龄幼虫体内甘油含量随降温速率的降低而逐渐升高，1.00 ℃/min和0.10 ℃/min降温处理与0.05 ℃/min处理间甘油含量差异显著（p<0.05）；当降温速率低至0.05 ℃/min时，冷驯化后诱导出虫体内甘油浓度最大，平均值为71.23 g/L，其后依次为50.14 g/L（0.10 ℃/min）、41.86 g/L（1.00 ℃/min）；不论降温速率快慢，低温冷驯化后试虫体内甘油含量均显著高于未经处理的空白组（32.54%）。
2.7 红棕象甲高龄幼虫总糖含量与耐寒性关系
如图6所示，红棕象甲高龄幼虫体内总糖含量随着降温速率的下降呈上升趋势。其中以0.05 ℃/min降温速率冷训后试虫体内总糖含量最高，平均值为59.56 μg/mg，总糖含量与其他两处理组（0.10 ℃/min、1.00 ℃/min）间差异极显著（p<0.01）；以1.00 ℃/min与0.10 ℃/min的降温速率处理试虫后体内总糖含量分别为20.49 μg/mg、24.41 μg/mg。
2.8 红棕象甲高龄幼虫血淋巴蛋白质含量与耐寒性关系
如图7所示，红棕象甲高龄幼虫血淋巴内蛋白质含量随降温速率的减少而减少，且3个处理组间差异极显著（p<0.01）。其中，以1.00 ℃/min降温速率冷驯化后试虫体内血淋巴内诱导蛋白质含量最高，平均值为26.89 mg/mL，约为空白组（6.53 mg/mL）血淋巴蛋白质含量的4～5倍；而以0.05 ℃/min 接近自然降温的冷驯化降温速率处理试虫后，试虫体内血淋巴内蛋白质含量剧减少至9.08 mg/mL。除0.05 ℃/min处理组诱导的蛋白质含量与未处理组测定的蛋白质含量差异不显著外（p>0.05），其余两组处理与空白组间差异都极显著（p>0.01）。由此可见，以0.05 ℃/min降温速率处理红棕象甲高龄幼虫后诱导的血淋巴蛋白质含量效果较差，而以1.00 ℃/min降温速率处理试虫后血淋巴内蛋白质含量急剧上升。
3 讨论与结论
3.1 不同降温速率与红棕象甲高龄幼虫存活率的关系
昆虫耐寒性并非随着降温速率的减少而增加，而是在一定范围内，随处理强度的增强而提高[20-22]。若当冷驯化强度进一步增强时则可能造成昆虫低温耐受性的降低，一定程度上抵消冷驯化对昆虫耐寒性的提高效果[23]，此结论适用于红棕象甲高龄幼虫，长时间的冷暴露并不能有效提高试虫的耐寒性，相反表现为削弱其耐寒性；而以1.00 ℃/min的降温速率处理试虫后其存活率较空白组存活率虽有所升高，但增长幅度不明显。笔者推测由于试虫暴露于低温下时间较短，所有个体并未充分进行冷驯化，仅少部分个体进入冷驯化阶段存活下来，大部分个体未经驯化直接暴露于低温下而造成冷伤害死亡，因此短时间的冷暴露亦不能有效提高试虫的耐寒性。此外，不同物种或同一物种不同发育阶段耐寒性大小均不完全一致，冷驯化强度及处理时间的选取应具较强针对性，海南省地处热带与亚热带交界，常年平均气温均在20 ℃以上[24]，定殖在此地区的昆虫极少会面临低温胁迫，零度以上的低温即可造成其大量死亡，因此本实验选取实验对象的冷驯化温度相对较高（5 ℃）。试验结果证明，以0.10 ℃/min的降温速率处理实验对象，冷驯化效果较理想；以1.00 ℃/min的降温速率处理试验对象，冷驯化效果增强，但不显著；而以0.05 ℃/min的降温速率进行冷驯化时，历时较长，削弱了试虫的耐寒性。因此，对于红棕象甲高龄幼虫而言，冷驯化有效的降温速率大致应位于1.00～0.10 ℃/min之间。 3.2 不同降温速率与红棕象甲高龄幼虫体内生理生化指标的关系
昆虫面临低温胁迫时体内出现一系列复杂的生理指标变化，如体内水含量、脂肪含量、小分子冷冻保护剂甘油、糖分以及诱导的抗冻蛋白含量的变化等，从而增强了对未结冰伤害和结冰伤害的抵抗能力[2]。本实验中，不同降温速率冷驯化后红棕象甲高龄幼虫体内各生理指标存在差异，以1.00 ℃/min的降温速率冷驯化处理红棕象甲高龄幼虫后，其体内水分含量急剧下降，但随着降温速率的减慢，试虫体内含水量逐渐下降；当以0.10 ℃/min的降温速率处理后试虫体内含水量达到最低值62.67%，若再以较慢的降温速率0.05 ℃/min处理试虫后虫体内含水量则逐渐升高，但存活率却降至最低，其含量变化与1.00 ℃/min降温速率处理后的试虫体内水分含量差异不显著（p>0.05），可视为虫体面临低温胁迫时的失水平衡状态，具体解释但还需进一步研究，同样的推测适用于脂肪含量的波动。而虫体内甘油含量和总糖含量与降温速率之间呈明显的负相关，即随着降温速率的减慢，体内诱导出的甘油含量与总糖含量不断上升，且均在0.05 ℃/min降温速率处理后含量急剧升高。甘油是昆虫面临低温胁迫过程中最普遍的抗冻保护剂[25-26]，但其含量的增加并未使试虫存活率升高，总糖含量的波动亦是如此；而血淋巴诱导出蛋白质含量随着降温速率的减少逐渐下降，可解释为红棕象甲高龄幼虫在面临低温胁迫时，血淋巴在短时间内会诱导出大量的抗冻蛋白，作为其短期抗寒物质，但具体由血淋巴中哪一类或哪几类蛋白质起着抗寒作用，还需进一步鉴定。
此外，对于热带或亚热带昆虫而言，虽极少会面临零度以下低温胁迫，但时常偶遇台风、暴雨或海啸等恶劣天气，气温会急剧下降，常年定殖在该类地区的昆虫因此也进化出相对的耐寒对策：即短时间内面临低温胁迫可诱导出大量抗寒物质的特性，为其抵抗寒冷环境，成功进入下一繁殖期提供必要条件。
参考文献
[1] Kelty J D， Lee Jr R E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster[J]. Journal of Insect Physiology， 1999， 45（8）： 719-726.
[2] 王宪辉， 齐宪磊， 康 乐. 昆虫的快速冷驯化现象及其生态适应意义[J]. 自然科学进展， 2003， 13（11）： 1 128-1 132.
[3] Lee R E， Chen C P， Denlinger D L. A rapid cold-hardening process in insects[J]. Science， 1987， 238： 1 415-1 417.
[4] Coulson S J， Bale J S. Characterisation and limitations of the rapid cold-hardening response in the housefly Musca domestica （Diptera： Muscidae）[J]. Journal of Insect Physiology， 1990， 36（3）： 207-211.
[5] Chen B. Kang L. Cold hardiness and supercooling capacity in the pea leafminer Liromyza huidobrensis[J]. CryoLetters， 2002， 23： 173-182.
[6] Broufas G D， Koveos D S. Rapid cold hardening in the predatory mite Euseius Amblyseius finlandicus（Acari： Phytoseiidae）[J]. Journal of Insect Physiology， 2001， 47（7）： 699-708.
[7] Worland R， Block W， Rothery P. Survival of sub-zero temperatures by two South Georgian beetles（Coleoptera， Perimylopidae）[J]. Polar Biology， 1992， 11（8）： 607-613.
[8] Shintani Y， Ishikawa Y. Relationship between rapid cold-hardening and cold acclimation in the eggs of the yellow-spotted longicorn beetle Psacothea hilaris[J]. Journal of Insect Physiology， 2007， 53（10）： 1 055-1 062.
[9] Larsen K J， Lee R E. Cold tolerance including rapid cold-hardening and inoculative freezing of fall migrant monarch butterflies in Ohio[J]. Journal of Insect Physiology， 1994， 40（10）： 859-864.
[10] 覃伟权， 李朝绪， 黄山春.红棕象甲在中国的风险性分析[J]. 江西农业学报， 2009， 21（9）： 79-82.
[11] 李 磊.红棕象甲基础生物生态学研究[D]. 海口： 海南大学， 2010. [12] 鞠瑞亭， 王 凤， 肖娱玉， 等. 上海地区红棕象甲的耐寒性研究[J]. 昆虫学报， 2010， 53（2）： 226-232.
[13] Abe F， Hata K， Sone K. Life History of the Red Palm Weevil， Rhynchophorous ferrugineus（Coleoptera： Dryophtoridae）， in Southern Japan[J]. Florida Entomologist， 2009， 92（3）： 421-425.
[14] 覃伟权， 马子龙， 吴多杨， 等. 几种引诱物对红棕象甲的诱集和田间监测[J]. 热带作物学报， 2004， 25（2）： 42-46.
[15] 耿济国， 张建新， 张孝羲. 昆虫生态及预测预报实验指导[M]. 北京： 农业出版社， 1991： 90-94.
[16] Chen C P， Denlinger D L， Lee R E. Cold-shock injury and rapid cold hardening in the flesh fly Sarcophaga crassipalpis[J]. Physiol Zool， 1987， 60（3）： 297-304.
[17] 郭 郛， 忻介六. 昆虫实验技术[M]. 北京： 科学出版社， 1988： 165-195.
[18] Che X B， Xia N B， Song C Y， et al. Study on the main Energy Substance Consumed by Dendrolimus tabulaeformis Tsai et Liu Adult During Migration[J]. Journal of Beijing Forestry University， 1996， 18（4）： 29-34.
[19] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical biochemistry， 1976， 72（1）： 248-254.
[20] Lee Jr R E. Insect cold-hardiness： To freeze or not to freeze[J]. Bioscience， 1989， 39（5）： 308-313.
[21] Ju R T， Xiao Y Y， Li B. Rapid cold hardening increases cold and chilling tolerances more than acclimation in the adults of the sycamore lace bug Corythucha ciliata（Hemiptera： Tingidae）[J]. Journal of Insect Physiology， 2011， 57（11）： 1 577-1 582.
[22] McDonald J R， Bale J S， Walters K F A. Rapid cold hardening in the western flower thrips Frankliniella occidentalis[J]. Journal of Insect Physiology， 1997， 43（8）： 759-766.
[23] 岳 雷， 郭建英， 周忠实， 等. 冷驯化对昆虫耐寒性及其适合度的影响[J]. 中国生物防治学报， 2013， 29（2）： 286-293.
[24] 唐少霞， 赵志忠， 毕 华， 等. 海南岛气候资源特征及其开发利用[J]. 海南师范大学学报（自然科学版）， 2008， 21（3）： 343-346.
[25] Jing X H， Kang L. Geographical variation in egg cold hardiness： a study on the adaptation strategies of the migratory locust Locusta migratoria L[J]. Ecological Entomology， 2003， 28（2）： 151-158.
[26] Terblanche J S， Marais E， Chown S L. Stage-related variation in rapid cold hardening as a test of the environmental predictability hypothesis[J]. Journal of Insect Physiology， 2007， 53（5）： 455-462.
关键词 红棕象甲；高龄幼虫；降温速率；冷驯化
中图分类号 Q965 文献标识码 A
Definitude of Effective Cooling Rates of Cold Acclimation
for Old larvae of Red Palm Weevil Rhynchophorous
ferrugineus（Oliver）
WAN Jie1，2， YAN Wei2 *， LIU Li2， LONG Xuefeng2， LI Chaoxu2， QIN Weiquan2 *
1 Environment and Plant Protection Department， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China
2 Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang， Hainan 571339， China
Abstract To clarify the effective cooling rates used in the cold acclimation process and preliminarily understand changes of physiological indictors of old larva of Red Palm Weevil Rhynchophorous ferrugineus（Oliver） RPW exposed to different cooling condition. We set three kinds of cooling rates（1.00， 0.10， 0.05 ℃/min）and ①cooled the subjects from 25 ℃ to 5 ℃， respectively， then transferred to -8 ℃ for 2 h and recorded the survival； ②Determined the correspondingly physiological changes related to the insect cold hardness after the subjects were experienced the cold hardening process with different cooling rates. Both experiments were compared with the relative control groups. The results showed that the optimal cooling rate was 0.10 ℃/min for the subjects； Besides， the content of lipid， glycerol， total sugar， and proteins from hemolymph were significantly higher than those of control groups， whereas the content of water was significantly lower than that of control groups.
Key words Rhynchophorous ferrugineus（Oliver）； Old larvae； Cooling rate； Cold acclimation
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.06.026
昆虫在经历胁迫低温之上一个较温和的低温后，能够增强其抵抗低温冷伤害能力，即耐寒性的现象称为冷驯化[1-2]。根据冷驯化时间的长短，又可将其划分为快速冷驯化与长期冷驯化。相对于长期研究的越冬冷驯化，快速冷驯化现象是近年才发现并受到了研究者们的普遍重视[3]。降温速率作为影响昆虫快速冷驯化重要因子之一最早发现于家蝇蛹的研究中[4]。大量研究表明较慢的降温速率能显著提高昆虫耐寒性[5]，但得出此结论的试验对象多属双翅目、鳞翅目或膜翅目等[4-6]。对于鞘翅目昆虫，国外某些报道中指出：接近环境降温的较慢的降温速率并不能显著提高昆虫的耐寒性[7-9]。
红棕象甲[Rhynchophorous ferrugineus（Oliver）]属鞘翅目象甲科蛀干性害虫，主要以幼虫取食树干或树冠心叶危害棕榈科植物，一旦钻入树内，通常6～8个月就会造成树体死亡，在大面积种植棕榈植物的热带地区频繁发生灾害，被列为我国进出口检疫性害虫之一[10]。世代重叠，冬季危害较小，主要以高龄幼虫、蛹、成虫越冬[11]。中国广泛分布于广东、台湾、云南、西藏（墨脱）、广西、浙江、海南等地，现今已扩散至上海（30～32°N）[12]，约同纬度地区国外的日本鹿儿岛（>31°N）也见其报道[13]。红棕象甲是否存在继续向北扩散的趋势，是目前研究者们希望探讨的问题。因此，本实验设定3种不同降温速率，观察不同降温速率对红棕象甲高龄幼虫低温冷驯化效果，明确其冷驯化有效降温速率范围以及不同降温速率对试虫体内相应理化指标的影响等，旨在明确红棕象甲高龄幼虫应对不同低温胁迫时其生理上适应性调整，为预测其向北扩散的潜在区域并采取相应有效的防控措施提供理论基础。 1 材料与方法
1.1 材料
供试成虫采于海南省文昌市椰子大观园，使用信息素诱集方法抓获后[14]，将成虫带回实验室。雌雄配对后将其置于广口瓶，瓶内悬挂含8%～10% 蜂蜜水的棉球供成虫取食产卵。然后将广口瓶置于温度为（28±0.5）℃，相对湿度75%±5%，光照周期L ∶ D=14 ∶ 10的人工气候箱（型号：PYX-300Q-B，广州深华生物技术有限公司）中培养。成虫产下卵后将卵转移至干净的培养皿，将培养皿继续放置人工气候箱中直至孵化为1龄幼虫，1龄幼虫到高龄幼虫之间以人工饲料饲养[11]。对于幼虫的饲养条件，除光照周期调整为L ∶ D=0 ∶ 24，其他饲养条件与成虫设置的饲养条件一致。根据发育天数和头壳宽度及颜色判断虫龄，挑选发育天数为68 d的高龄幼虫作为试验对象，试虫均为野外种群在室内人工饲养的F1代。
1.2 方法
1.2.1 过冷却点的测定 采用热电偶方法进行测定[15]，仪器主要有高低温湿热箱（型号：GDJS-100，沈阳林频实验设备有限公司）和过冷却点测定仪（SUN-V型智能昆虫过冷却点测定仪）组成。试验重复3次，每次处理8头幼虫，记录过冷却点值。
1.2.2 检测温度的确定 对于大多数昆虫的快速冷驯化试验，检测方法沿用Chen等[16]最初研究麻蝇时提出的试验方案。由上一步确定的红棕象甲高龄幼虫过冷却点为-8.37 ℃。设计从0 ℃到-8.37 ℃之间一系列温度梯度，分别为：0、-2、-4、-6、-8 ℃，然后把高龄幼虫从正常的饲养温度直接转移到系列温度下处理2 h，然后再将其取出置于常温下恢复1 d后，观察并统计其存活率。以毛笔拨动虫体表，若试虫出现蠕动或缓慢爬行则视为存活；虫体发黑变硬且无明显肢体蠕动则视为死亡。选择存活率在15%～30%对应的温度作为检测温度。本实验设定红棕象甲高龄幼虫的检测温度为：-8 ℃下处理2 h。每次处理组选取8头幼虫，每个处理重复3次。
1.2.3 不同降温速率对红棕象甲高龄幼虫存活率的影响 挑选健康且大小均匀的高龄幼虫将其置于高低温湿热箱中（型号：LP/GDJS-100，沈阳林频），分别设定3种降温速率（1.00、0.10、0.05 ℃/min）从25 ℃降到5 ℃，然后将每组处理转移置检测温度-8 ℃下2 h后，取出置于室温下恢复1 d，观察并统计存活率。实验设置空白组，即将未经冷驯化处理的试虫直接转移置检测温度下处理2 h后取出，恢复1 d并统计其存活率。每组处理8头幼虫，每个处理重复3次。
1.2.4 不同降温速率对红棕象甲高龄幼虫体内生理指标的影响
（1）虫体含水量测定。挑选健康且大小均匀的高龄幼虫，用棉花将试虫体表清理干净并吸干水分后称取各幼虫样品鲜重，记为FM（fresh mass），然后将试虫置于60 ℃恒温培养箱中干燥3 d后取出，分别称量单头虫体干重记为DM（dry mass）。体内含水率/%=（FM-DM）/FM×100。每组处理8头幼虫，每个处理重复3次。
（2）虫体游离脂肪含量的测定。将试虫置于60 ℃烘干箱中烘干3 d后，取出并充分研磨，然后取一定量研磨液（体内油脂含量较高）M装入滤纸筒内，称重滤纸与研磨液总质量记为M1，将滤纸筒放入索氏提取器内，加入纯乙醚，在60 ℃加热回流提取5 h，然后将蒸馏瓶加热除去残余乙醚并干燥，取出干燥后的滤纸筒并称重记为M2。游离粗脂肪/%=（M2-M1）/M×100。每个处理8头试虫，每组处理重复3次。
（3）虫体甘油含量的测定。绘制标准曲线：分别在6支10 mL离心试管内注入15%的CuSO4溶液0.3 mL和5%的NaOH溶液3.5mL，配制Cu（OH）2悬浊液，再加入50%的甘油溶液和蒸馏水，使甘油的含量依次为40.0、45.0、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0 g/L，充分震荡，离心分离后取上清液分别置于比色皿中，在630 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线。虫体甘油含量测定：绘制标准曲线后取脂类提取液0.1 mL注入10 mL离心试管内，加浓H2SO4 2 mL，在沸水浴中消化，加入Cu（OH）2悬浊液，离心分离，取上清液用分光光度计测其吸光值，查标准曲线得虫体甘油含量[17]。每个处理8头试虫，每组处理重复3次
（4）虫体总糖含量测定。采用蒽酮法测定糖原含量[18]，取充分研磨的幼虫0.3 g，加1 mL 30% KOH，设置3次重复，沸水浴30 min左右，直到水解液清澈透明无颗粒为止。冷却后移入离心管，加入3 mL 95%乙醇。将离心管放在冰箱内过夜，次日离心（10 min，3 500 r/min）弃上清液，再将沉淀溶于1 mL蒸馏水中，并加入4 mL乙醇（95%），在冰箱内放置3～4 h，离心弃上清液，沉淀用蒸馏水溶解过滤并定容于25 mL容量瓶中即得样品待测液。每个处理8头试虫，每组处理重复3次
（5）血淋巴中蛋白质含量的测定。在1.5 mL离心管内加入苯基硫脲晶体数粒防止黑化，置冰浴上预冷，然后将试虫用蒸馏水冲洗净后用滤纸吸去体表水渍，然后用手揉捏试虫几下后捏紧虫体，用针孔刺破虫体表使血淋巴滴出，用40 μL移液枪直接收集血淋巴于预冷的离心管内，收集完后将其保存于-70 ℃冰箱待用。参照 Bradford[19]方法，配制1 mg/mL的BSA（牛血清白蛋白）标准蛋白液，并绘制标准曲线。血淋巴蛋白质测定时，先将血淋巴稀释10倍，取4 μL稀释液，加入蒸馏水补足至1 mL，加入3 mL考马斯亮蓝染色液，25 ℃保温15 min，于595 nm处测光吸收值，从标准曲线上求出血淋巴蛋白含量。每组处理8只试虫，每个处理重复3次。
1.3 数据分析
采用SPSS 15.0软件对试验数据进行统计分析，获取平均值及标准差，不同处理间差异进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncan多重比较。 2 结果与分析
2.1 红棕象甲高龄幼虫过冷却点测定
如表1所示，红棕象甲高龄幼虫过冷却点（Supercooling point）（SCP）差异较显著（p<0.05），平均值为（-8.58±2.6）℃；其中，最高值为-4.43 ℃，最低值为-13.78 ℃。
2.2 检测温度的确定
如图1所示，将红棕象甲高龄幼虫置于不同低温梯度下处理2 h后，其存活率随低温温度的降低而减少，直至暴露于-8 ℃下2 h，平均存活率为16.67%，因此选此温度作为检测温度。
2.3 不同降温速率对红棕象甲高龄幼虫存活率的影响
如图2所示，分别以1.00、0.10、0.05 ℃/min的降温速率冷驯化试虫后其存活率间差异显著（p<0.05），且0.10 ℃/min降温速率处理组的存活率与空白组间存活率差异极显著（p<0.01），冷驯化后试虫存活率平均值提高至45.83%，约为空白组存活率（16.67%）的2～3倍；另两处理组与空白组间差异不显著（p>0.05），依次为1.00 ℃/min（20.83%）和0.05 ℃/min（8.33%）；而以0.05 ℃/min降温速率处理后红棕象甲高龄幼虫的存活率却低于未经冷驯化处理对照组的存活率，可看出0.05 ℃/min的降温速率处理后并未增强其耐寒性，而是削弱了红棕象甲高龄幼虫的耐寒性。
2.4 红棕象甲高龄幼虫体内水分含量与存活率之间的关系
如图3所示，分别以3种降温速率冷驯化红棕象甲高龄幼虫后，处理组试虫体内含水量均低于空白组试虫的含水量，分别为68.02%（1.00 ℃/min）、62.67%（0.10 ℃/min）、67.42%（0.05 ℃/min）；其中以0.10 ℃/min处理组含水率与空白组含水率（71.12%）间差异极显著（p<0.01），且与其他二组间差异显著（p<0.05）；其他两组含水率均与空白组间含水率差异不显著（p>0.05）。
2.5 红棕象甲高龄幼虫体内游离脂肪含量与耐寒性的关系
由图4可知，红棕象甲高龄幼虫体内脂肪含量在不同降温速率1.00、0.10、0.05℃/min处理组间差异不显著（p>0.05），处理后脂肪含量分别为57.25%、52.62%、58.29%；但1.00 ℃/min与0.05 ℃/min降温速率处理后试虫体内脂肪含量均显著高于未经冷驯化的空白组试虫体内脂肪含量（42.76%）（p<0.05）；而0.10 ℃/min的降温速率处理后试虫体内脂肪含量较空白组含量高，但差异不显著（p>0.05）；1.00 ℃/min与0.05 ℃/min冷驯化后的虫体内脂肪含量较高，但二者之间差异不显著。
2.6 红棕象甲高龄幼虫体内甘油含量与耐寒性的关系
从图5可以看出，红棕象甲高龄幼虫体内甘油含量随降温速率的降低而逐渐升高，1.00 ℃/min和0.10 ℃/min降温处理与0.05 ℃/min处理间甘油含量差异显著（p<0.05）；当降温速率低至0.05 ℃/min时，冷驯化后诱导出虫体内甘油浓度最大，平均值为71.23 g/L，其后依次为50.14 g/L（0.10 ℃/min）、41.86 g/L（1.00 ℃/min）；不论降温速率快慢，低温冷驯化后试虫体内甘油含量均显著高于未经处理的空白组（32.54%）。
2.7 红棕象甲高龄幼虫总糖含量与耐寒性关系
如图6所示，红棕象甲高龄幼虫体内总糖含量随着降温速率的下降呈上升趋势。其中以0.05 ℃/min降温速率冷训后试虫体内总糖含量最高，平均值为59.56 μg/mg，总糖含量与其他两处理组（0.10 ℃/min、1.00 ℃/min）间差异极显著（p<0.01）；以1.00 ℃/min与0.10 ℃/min的降温速率处理试虫后体内总糖含量分别为20.49 μg/mg、24.41 μg/mg。
2.8 红棕象甲高龄幼虫血淋巴蛋白质含量与耐寒性关系
如图7所示，红棕象甲高龄幼虫血淋巴内蛋白质含量随降温速率的减少而减少，且3个处理组间差异极显著（p<0.01）。其中，以1.00 ℃/min降温速率冷驯化后试虫体内血淋巴内诱导蛋白质含量最高，平均值为26.89 mg/mL，约为空白组（6.53 mg/mL）血淋巴蛋白质含量的4～5倍；而以0.05 ℃/min 接近自然降温的冷驯化降温速率处理试虫后，试虫体内血淋巴内蛋白质含量剧减少至9.08 mg/mL。除0.05 ℃/min处理组诱导的蛋白质含量与未处理组测定的蛋白质含量差异不显著外（p>0.05），其余两组处理与空白组间差异都极显著（p>0.01）。由此可见，以0.05 ℃/min降温速率处理红棕象甲高龄幼虫后诱导的血淋巴蛋白质含量效果较差，而以1.00 ℃/min降温速率处理试虫后血淋巴内蛋白质含量急剧上升。
3 讨论与结论
3.1 不同降温速率与红棕象甲高龄幼虫存活率的关系
昆虫耐寒性并非随着降温速率的减少而增加，而是在一定范围内，随处理强度的增强而提高[20-22]。若当冷驯化强度进一步增强时则可能造成昆虫低温耐受性的降低，一定程度上抵消冷驯化对昆虫耐寒性的提高效果[23]，此结论适用于红棕象甲高龄幼虫，长时间的冷暴露并不能有效提高试虫的耐寒性，相反表现为削弱其耐寒性；而以1.00 ℃/min的降温速率处理试虫后其存活率较空白组存活率虽有所升高，但增长幅度不明显。笔者推测由于试虫暴露于低温下时间较短，所有个体并未充分进行冷驯化，仅少部分个体进入冷驯化阶段存活下来，大部分个体未经驯化直接暴露于低温下而造成冷伤害死亡，因此短时间的冷暴露亦不能有效提高试虫的耐寒性。此外，不同物种或同一物种不同发育阶段耐寒性大小均不完全一致，冷驯化强度及处理时间的选取应具较强针对性，海南省地处热带与亚热带交界，常年平均气温均在20 ℃以上[24]，定殖在此地区的昆虫极少会面临低温胁迫，零度以上的低温即可造成其大量死亡，因此本实验选取实验对象的冷驯化温度相对较高（5 ℃）。试验结果证明，以0.10 ℃/min的降温速率处理实验对象，冷驯化效果较理想；以1.00 ℃/min的降温速率处理试验对象，冷驯化效果增强，但不显著；而以0.05 ℃/min的降温速率进行冷驯化时，历时较长，削弱了试虫的耐寒性。因此，对于红棕象甲高龄幼虫而言，冷驯化有效的降温速率大致应位于1.00～0.10 ℃/min之间。 3.2 不同降温速率与红棕象甲高龄幼虫体内生理生化指标的关系
昆虫面临低温胁迫时体内出现一系列复杂的生理指标变化，如体内水含量、脂肪含量、小分子冷冻保护剂甘油、糖分以及诱导的抗冻蛋白含量的变化等，从而增强了对未结冰伤害和结冰伤害的抵抗能力[2]。本实验中，不同降温速率冷驯化后红棕象甲高龄幼虫体内各生理指标存在差异，以1.00 ℃/min的降温速率冷驯化处理红棕象甲高龄幼虫后，其体内水分含量急剧下降，但随着降温速率的减慢，试虫体内含水量逐渐下降；当以0.10 ℃/min的降温速率处理后试虫体内含水量达到最低值62.67%，若再以较慢的降温速率0.05 ℃/min处理试虫后虫体内含水量则逐渐升高，但存活率却降至最低，其含量变化与1.00 ℃/min降温速率处理后的试虫体内水分含量差异不显著（p>0.05），可视为虫体面临低温胁迫时的失水平衡状态，具体解释但还需进一步研究，同样的推测适用于脂肪含量的波动。而虫体内甘油含量和总糖含量与降温速率之间呈明显的负相关，即随着降温速率的减慢，体内诱导出的甘油含量与总糖含量不断上升，且均在0.05 ℃/min降温速率处理后含量急剧升高。甘油是昆虫面临低温胁迫过程中最普遍的抗冻保护剂[25-26]，但其含量的增加并未使试虫存活率升高，总糖含量的波动亦是如此；而血淋巴诱导出蛋白质含量随着降温速率的减少逐渐下降，可解释为红棕象甲高龄幼虫在面临低温胁迫时，血淋巴在短时间内会诱导出大量的抗冻蛋白，作为其短期抗寒物质，但具体由血淋巴中哪一类或哪几类蛋白质起着抗寒作用，还需进一步鉴定。
此外，对于热带或亚热带昆虫而言，虽极少会面临零度以下低温胁迫，但时常偶遇台风、暴雨或海啸等恶劣天气，气温会急剧下降，常年定殖在该类地区的昆虫因此也进化出相对的耐寒对策：即短时间内面临低温胁迫可诱导出大量抗寒物质的特性，为其抵抗寒冷环境，成功进入下一繁殖期提供必要条件。
参考文献
[1] Kelty J D， Lee Jr R E. Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster[J]. Journal of Insect Physiology， 1999， 45（8）： 719-726.
[2] 王宪辉， 齐宪磊， 康 乐. 昆虫的快速冷驯化现象及其生态适应意义[J]. 自然科学进展， 2003， 13（11）： 1 128-1 132.
[3] Lee R E， Chen C P， Denlinger D L. A rapid cold-hardening process in insects[J]. Science， 1987， 238： 1 415-1 417.
[4] Coulson S J， Bale J S. Characterisation and limitations of the rapid cold-hardening response in the housefly Musca domestica （Diptera： Muscidae）[J]. Journal of Insect Physiology， 1990， 36（3）： 207-211.
[5] Chen B. Kang L. Cold hardiness and supercooling capacity in the pea leafminer Liromyza huidobrensis[J]. CryoLetters， 2002， 23： 173-182.
[6] Broufas G D， Koveos D S. Rapid cold hardening in the predatory mite Euseius Amblyseius finlandicus（Acari： Phytoseiidae）[J]. Journal of Insect Physiology， 2001， 47（7）： 699-708.
[7] Worland R， Block W， Rothery P. Survival of sub-zero temperatures by two South Georgian beetles（Coleoptera， Perimylopidae）[J]. Polar Biology， 1992， 11（8）： 607-613.
[8] Shintani Y， Ishikawa Y. Relationship between rapid cold-hardening and cold acclimation in the eggs of the yellow-spotted longicorn beetle Psacothea hilaris[J]. Journal of Insect Physiology， 2007， 53（10）： 1 055-1 062.
[9] Larsen K J， Lee R E. Cold tolerance including rapid cold-hardening and inoculative freezing of fall migrant monarch butterflies in Ohio[J]. Journal of Insect Physiology， 1994， 40（10）： 859-864.
[10] 覃伟权， 李朝绪， 黄山春.红棕象甲在中国的风险性分析[J]. 江西农业学报， 2009， 21（9）： 79-82.
[11] 李 磊.红棕象甲基础生物生态学研究[D]. 海口： 海南大学， 2010. [12] 鞠瑞亭， 王 凤， 肖娱玉， 等. 上海地区红棕象甲的耐寒性研究[J]. 昆虫学报， 2010， 53（2）： 226-232.
[13] Abe F， Hata K， Sone K. Life History of the Red Palm Weevil， Rhynchophorous ferrugineus（Coleoptera： Dryophtoridae）， in Southern Japan[J]. Florida Entomologist， 2009， 92（3）： 421-425.
[14] 覃伟权， 马子龙， 吴多杨， 等. 几种引诱物对红棕象甲的诱集和田间监测[J]. 热带作物学报， 2004， 25（2）： 42-46.
[15] 耿济国， 张建新， 张孝羲. 昆虫生态及预测预报实验指导[M]. 北京： 农业出版社， 1991： 90-94.
[16] Chen C P， Denlinger D L， Lee R E. Cold-shock injury and rapid cold hardening in the flesh fly Sarcophaga crassipalpis[J]. Physiol Zool， 1987， 60（3）： 297-304.
[17] 郭 郛， 忻介六. 昆虫实验技术[M]. 北京： 科学出版社， 1988： 165-195.
[18] Che X B， Xia N B， Song C Y， et al. Study on the main Energy Substance Consumed by Dendrolimus tabulaeformis Tsai et Liu Adult During Migration[J]. Journal of Beijing Forestry University， 1996， 18（4）： 29-34.
[19] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical biochemistry， 1976， 72（1）： 248-254.
[20] Lee Jr R E. Insect cold-hardiness： To freeze or not to freeze[J]. Bioscience， 1989， 39（5）： 308-313.
[21] Ju R T， Xiao Y Y， Li B. Rapid cold hardening increases cold and chilling tolerances more than acclimation in the adults of the sycamore lace bug Corythucha ciliata（Hemiptera： Tingidae）[J]. Journal of Insect Physiology， 2011， 57（11）： 1 577-1 582.
[22] McDonald J R， Bale J S， Walters K F A. Rapid cold hardening in the western flower thrips Frankliniella occidentalis[J]. Journal of Insect Physiology， 1997， 43（8）： 759-766.
[23] 岳 雷， 郭建英， 周忠实， 等. 冷驯化对昆虫耐寒性及其适合度的影响[J]. 中国生物防治学报， 2013， 29（2）： 286-293.
[24] 唐少霞， 赵志忠， 毕 华， 等. 海南岛气候资源特征及其开发利用[J]. 海南师范大学学报（自然科学版）， 2008， 21（3）： 343-346.
[25] Jing X H， Kang L. Geographical variation in egg cold hardiness： a study on the adaptation strategies of the migratory locust Locusta migratoria L[J]. Ecological Entomology， 2003， 28（2）： 151-158.
[26] Terblanche J S， Marais E， Chown S L. Stage-related variation in rapid cold hardening as a test of the environmental predictability hypothesis[J]. Journal of Insect Physiology， 2007， 53（5）： 455-462.