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摘要：目的：探讨生殖支原体（Mg）脂蛋白（LP）对TNF-α诱导HeLa细胞凋亡的抑制作用；方法：从生殖支原体分离膜蛋白，随后将不同浓度的LP作用于HeLa细胞，采用Annexin V-FITC-PI染色法检测用PBS、LP、TNF-α和LP + TNF-α处理过的细胞凋亡情况。结果：TNF-α诱导凋亡组的HeLa细胞凋亡率（15.55±7.83%）明显高于Mg LP+TNF-α组、Mg LP组、PBS组，具有统计学差异（P<0.05）；Mg LP+TNF-α组凋亡率（9.41±4.52%）高于Mg LP组（4.89±4.19%），具有统计学差异（P<0.05）。结论：生殖支原体脂蛋白对TNF-α诱导的HeLa细胞凋亡具有抑制作用。
关键词：生殖支原体；膜蛋白；细胞凋亡；前炎症细胞因子
生殖支原体是目前发现的基因组最简单、体积最小的原核细胞型微生物。生殖支原体要寄生于灵长类动物和人的呼吸道黏膜、泌尿生殖道及关节腔滑液中[1]。近年来，关于生殖支原体脂蛋白越来越多。本文主要探讨生殖支原体脂蛋白对TNF-α诱导HeLa细胞凋亡的抑制作用。现报道如下。
1. 材料与方法
1.1 主要材料 Annexin-V-FITC-PI试剂盒、人TNF-αELISA 试剂盒（北京晶美公司）；HeLa细胞株：为南华大学病原生物学研究所保存；改良SP-4培养基按 Tully设计的SP-4基本配方配制；PBS、培养基等均参考《精编分子生物学指南》附录部分。无支原体新生牛血清（杭州四季青公司）。低温高速离心机（德国 HETTICH 公司）。
1.2 方法
1.2.1 提取生殖支原体脂蛋白 （1）培养生殖支原体：在含95%的N2、5%的CO2、37℃下，将生殖支原体接种在含青霉素的改良SP4固体培养基中，培养 3-7d，低倍镜下可见“油煎蛋”样菌落后，挑取单个菌落在 37℃、改良SP4液体培养基培养 3-7d，培养基的颜色清亮，由红变黄，说明生殖支原体已生长至对数期。（2）收集生殖支原体：取500mL 生长的生殖支原体培养物在14000rpm/ml下离心10min，收集生殖支原体沉渣重悬于5mLTBSE[0.15M NaCl，50Mm Tris（pH8.0），1mM EDTA]，加TX-114至浓度为2%，4℃静置1h，将Mg裂解物在37℃温育10min，使其相分离，以14000rpm离心20min，去上层水相，加入等体积的4℃TBSE，混匀后4℃静置10min。相分离过程重复 2 次。（3）收集脂蛋白：将发生相分离后的 TX-114 相用 4℃ TBSE 重悬至初体积，加入2.5 倍体积无水乙醇，-20℃过夜以沉淀膜成分，经离心后用 PBS 重悬沉渣并经超声处理即为所要提取的脂蛋白。
1.2.2 HeLa细胞的培养和刺激 在37℃、含5%CO2的恒湿培养箱中用含10%新生牛血清的 DMEM 培养基培养HeLa 细胞；控制细胞密度在1.0-1.5×106/mL，控制细胞呈单层生长铺满培养瓶 80%左右后，使用胰酶消化处理后进行细胞传代。
1.2.3 Annexin V-FITC-PI染色法检测HeLa细胞凋亡 经10μg/mL的LP、TNF-α（10ng/mL）和 LP+ TNF-α处理细胞，同时用PBS作为阴性对照。按 Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒操作说明书进行凋亡检测HeLa细胞凋亡。
1.3 统计学处理 所有重复实验数据均以均数±标准差（X+S）表示，采用SPSS17.0统计分析软件对研究数据进行统计分析，计数资料之间的比较采用卡方检验进行分析，统计结果以P<0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 各组HeLa细胞凋亡结果比较 TNF-α诱导凋亡组的HeLa细胞凋亡率（15.55±7.83%）明显高于Mg LP+TNF-α组、Mg LP组、PBS组，具有统计学差异（P<0.05）；Mg LP+TNF-α组凋亡率（9.41±4.52%）高于Mg LP组（4.89±4.19%），具有统计学差异（P<0.05）。详见表1.
表1.各组HeLa细胞凋亡结果比较
3. 讨论
生殖支原体脂蛋白是暴露在表面与周围环境相互作用，影响机体免疫系统的一种主要蛋白，此外，该膜蛋白可能是介导支原体黏附宿主细胞表面，进而入侵宿主细胞而导致细胞受损伤的物质基础[2]。细胞凋亡是個体发育过程中在基因调控下的细胞自杀性的行为，是为了维护内外环境稳定，调控机体发育，由基因编码程序的细胞主动死亡过程[3]。TNF-α与TNF受体结合，激活了caspase的级联反应而最终引发HeLa细胞凋亡。过去关于支原体膜蛋白研究大多认为其可以引起单核淋巴细胞或者是巨噬细胞凋亡，但是有些研究认为该膜蛋白是不会引起细胞凋亡甚至是削弱了细胞的凋亡[4，5]。本实验通过流式细胞仪从微观的角度使用TNF-α诱导细胞凋亡来检测生殖支原体脂蛋白是否可以抑制 HeLa 细胞的凋亡。研究结果表明，TNF-α诱导凋亡组的HeLa细胞凋亡率（15.55±7.83%）明显高于Mg LP+TNF-α组、Mg LP组、PBS组，具有统计学差异（P<0.05）；Mg LP+TNF-α组凋亡率（9.41±4.52%）高于Mg LP组（4.89±4.19%），具有统计学差异（P<0.05）。可见，生殖支原体脂蛋白对TNF-α诱导的HeLa细胞凋亡具有抑制作用。本研究使用的是生殖支原体脂蛋白，对于胞浆蛋白、活的生殖支原体感染宿主细胞时的情况并未更进一步的了解，生殖支原体的致病研究大多是建立在细胞模型基础上的，而动物模型极少，故生殖支原体的研究还需进行许多的工作。
参考文献：
[1] 刘小丽，王若光.TNF-α对妊娠脱膜重塑机制的调节作用[J].实用预防医学，2006，13（ 2） ：471.
[2] 冯丽艳，刘桂艳，廖 琪，等.TNF-α在妊娠期肝内胆汁淤积症中的变化研究[J].中国优生与遗传杂志，2011，19（ 8） ：73.
[3] 秦明春，王若光，尤昭玲，李春梅，贺兰，匡继林，刘小丽.黄芩苷对TNF-α诱导下人脐静脉血管内皮细胞影响的初步研究[J].时珍国医国药，2014，25（8）：2016-2019.
[4] 魏璇，杜雪，李咏梅，赵曼茵，马雪梅，杜秀英，张一兵.VEGF-C诱导宫颈癌Hela细胞Bcl-2、cyclinD1的表达[J].实用预防医学， 2014，21（2） ：135-138.
[5] 何军，曾焱华，游晓星，伍绍坚，田巍，刘君，吴移谋.CD14对生殖支原体LAMPs激活NF-κB的影响[J].中国人兽共患病学报，2014，30（8）：797-799.
关键词：生殖支原体；膜蛋白；细胞凋亡；前炎症细胞因子
生殖支原体是目前发现的基因组最简单、体积最小的原核细胞型微生物。生殖支原体要寄生于灵长类动物和人的呼吸道黏膜、泌尿生殖道及关节腔滑液中[1]。近年来，关于生殖支原体脂蛋白越来越多。本文主要探讨生殖支原体脂蛋白对TNF-α诱导HeLa细胞凋亡的抑制作用。现报道如下。
1. 材料与方法
1.1 主要材料 Annexin-V-FITC-PI试剂盒、人TNF-αELISA 试剂盒（北京晶美公司）；HeLa细胞株：为南华大学病原生物学研究所保存；改良SP-4培养基按 Tully设计的SP-4基本配方配制；PBS、培养基等均参考《精编分子生物学指南》附录部分。无支原体新生牛血清（杭州四季青公司）。低温高速离心机（德国 HETTICH 公司）。
1.2 方法
1.2.1 提取生殖支原体脂蛋白 （1）培养生殖支原体：在含95%的N2、5%的CO2、37℃下，将生殖支原体接种在含青霉素的改良SP4固体培养基中，培养 3-7d，低倍镜下可见“油煎蛋”样菌落后，挑取单个菌落在 37℃、改良SP4液体培养基培养 3-7d，培养基的颜色清亮，由红变黄，说明生殖支原体已生长至对数期。（2）收集生殖支原体：取500mL 生长的生殖支原体培养物在14000rpm/ml下离心10min，收集生殖支原体沉渣重悬于5mLTBSE[0.15M NaCl，50Mm Tris（pH8.0），1mM EDTA]，加TX-114至浓度为2%，4℃静置1h，将Mg裂解物在37℃温育10min，使其相分离，以14000rpm离心20min，去上层水相，加入等体积的4℃TBSE，混匀后4℃静置10min。相分离过程重复 2 次。（3）收集脂蛋白：将发生相分离后的 TX-114 相用 4℃ TBSE 重悬至初体积，加入2.5 倍体积无水乙醇，-20℃过夜以沉淀膜成分，经离心后用 PBS 重悬沉渣并经超声处理即为所要提取的脂蛋白。
1.2.2 HeLa细胞的培养和刺激 在37℃、含5%CO2的恒湿培养箱中用含10%新生牛血清的 DMEM 培养基培养HeLa 细胞；控制细胞密度在1.0-1.5×106/mL，控制细胞呈单层生长铺满培养瓶 80%左右后，使用胰酶消化处理后进行细胞传代。
1.2.3 Annexin V-FITC-PI染色法检测HeLa细胞凋亡 经10μg/mL的LP、TNF-α（10ng/mL）和 LP+ TNF-α处理细胞，同时用PBS作为阴性对照。按 Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒操作说明书进行凋亡检测HeLa细胞凋亡。
1.3 统计学处理 所有重复实验数据均以均数±标准差（X+S）表示，采用SPSS17.0统计分析软件对研究数据进行统计分析，计数资料之间的比较采用卡方检验进行分析，统计结果以P<0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 各组HeLa细胞凋亡结果比较 TNF-α诱导凋亡组的HeLa细胞凋亡率（15.55±7.83%）明显高于Mg LP+TNF-α组、Mg LP组、PBS组，具有统计学差异（P<0.05）；Mg LP+TNF-α组凋亡率（9.41±4.52%）高于Mg LP组（4.89±4.19%），具有统计学差异（P<0.05）。详见表1.
表1.各组HeLa细胞凋亡结果比较
3. 讨论
生殖支原体脂蛋白是暴露在表面与周围环境相互作用，影响机体免疫系统的一种主要蛋白，此外，该膜蛋白可能是介导支原体黏附宿主细胞表面，进而入侵宿主细胞而导致细胞受损伤的物质基础[2]。细胞凋亡是個体发育过程中在基因调控下的细胞自杀性的行为，是为了维护内外环境稳定，调控机体发育，由基因编码程序的细胞主动死亡过程[3]。TNF-α与TNF受体结合，激活了caspase的级联反应而最终引发HeLa细胞凋亡。过去关于支原体膜蛋白研究大多认为其可以引起单核淋巴细胞或者是巨噬细胞凋亡，但是有些研究认为该膜蛋白是不会引起细胞凋亡甚至是削弱了细胞的凋亡[4，5]。本实验通过流式细胞仪从微观的角度使用TNF-α诱导细胞凋亡来检测生殖支原体脂蛋白是否可以抑制 HeLa 细胞的凋亡。研究结果表明，TNF-α诱导凋亡组的HeLa细胞凋亡率（15.55±7.83%）明显高于Mg LP+TNF-α组、Mg LP组、PBS组，具有统计学差异（P<0.05）；Mg LP+TNF-α组凋亡率（9.41±4.52%）高于Mg LP组（4.89±4.19%），具有统计学差异（P<0.05）。可见，生殖支原体脂蛋白对TNF-α诱导的HeLa细胞凋亡具有抑制作用。本研究使用的是生殖支原体脂蛋白，对于胞浆蛋白、活的生殖支原体感染宿主细胞时的情况并未更进一步的了解，生殖支原体的致病研究大多是建立在细胞模型基础上的，而动物模型极少，故生殖支原体的研究还需进行许多的工作。
参考文献：
[1] 刘小丽，王若光.TNF-α对妊娠脱膜重塑机制的调节作用[J].实用预防医学，2006，13（ 2） ：471.
[2] 冯丽艳，刘桂艳，廖 琪，等.TNF-α在妊娠期肝内胆汁淤积症中的变化研究[J].中国优生与遗传杂志，2011，19（ 8） ：73.
[3] 秦明春，王若光，尤昭玲，李春梅，贺兰，匡继林，刘小丽.黄芩苷对TNF-α诱导下人脐静脉血管内皮细胞影响的初步研究[J].时珍国医国药，2014，25（8）：2016-2019.
[4] 魏璇，杜雪，李咏梅，赵曼茵，马雪梅，杜秀英，张一兵.VEGF-C诱导宫颈癌Hela细胞Bcl-2、cyclinD1的表达[J].实用预防医学， 2014，21（2） ：135-138.
[5] 何军，曾焱华，游晓星，伍绍坚，田巍，刘君，吴移谋.CD14对生殖支原体LAMPs激活NF-κB的影响[J].中国人兽共患病学报，2014，30（8）：797-799.