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摘要：为比较猪链球菌中gidA缺失菌株与野生菌株氨基酸代谢之间的差异，揭示GidA调控氨基酸代谢的规律，为猪链球菌致病性的解析以及防控提供理论依据，分别收集gidA缺失菌株、野生菌株菌体，采用高效液相色谱法（HPLC）、质谱仪在正离子模式下进行质谱分析，检测样本中30种氨基酸及其衍生物的含量，比较gidA缺失菌株、野生菌株菌体中氨基酸代谢谱的差异。结果表明，2种菌株中精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、肌酸酐及鸟氨酸具有显著差异（P<0.05，倍数差异>1.2），其中精氨酸上调约4倍，天冬酰胺下调约17倍。说明tRNA修饰酶GidA缺失引起猪链球菌氨基酸代谢异常，尤其是精氨酸与天冬酰胺，其机制可能与猪链球菌致病性下降相关。
关键词：猪链球菌;tRNA修饰酶;GidA;氨基酸代谢
中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章編号：1007-273X（2021）07-0010-03
猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是一种重要的人兽共患传染病病原菌，不仅感染猪还感染人，严重时导致败血症型休克甚至死亡，给养猪业造成重大的经济损失，也威胁着人类的身体健康和生命安全[1-3]。tRNA修饰酶葡萄糖抑制分裂蛋白A（Glucose inhibited division protein A，GidA）是全局性的调控因子，对细菌的生长以及致病性具有重要的调控作用[4]，然而GidA蛋白对猪链球菌的氨基酸代谢谱的影响尚未见文献报道。本研究利用多反应监测技术，以标准品为参照，对特定氨基酸代谢物群进行有针对性、特异性的检测与分析，发现GidA对猪链球菌的氨基酸代谢谱产生了严重的扰动，尤其是精氨酸，而精氨酸代谢又与猪链球菌致病性相关。毒力因子ADS 是精氨酸代谢的重要途径，广泛存在于原核生物体内。ADS主要由精氨酸脱亚氨ArcA、ArcB 和ArcC 3种核心酶组成，通过上述核心酶的作用最终将精氨酸催化降解生成鸟氨酸、二氧化碳、氨和ATP，为细菌提供能量以及增强细菌对酸性环境的适应性。因此，本研究为猪链球菌致病性的解析以及防控提供了新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验仪器和试剂
试验仪器：5500 QTRAP质谱仪（AB SCIEX），Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统，低温高速离心机（Eppendorf 5430R），色谱柱Zic-HILIC 3.5 ?m，2.1 mm×150 mm Column。
试剂：甲酸（Fluka，06450），乙腈（Merck，1499230-935），甲醇（Merck，144282），所有氨基酸及其衍生物的标准品均购自Sigma-Aldrich。
1.2 代谢物提取
取细菌菌体样本，每个样本中加入1 mL 预冷甲醇/乙腈/水（2∶2∶1，V/V/V），转移至1.5 mL离心管中，涡旋混合，冰浴中超声30 min，-20 ℃孵育1 h用于沉淀蛋白，14 000 r/min 4 ℃离心20 min，取上清，真空干燥。质谱检测时加入100 μL乙腈-水溶液（1∶1，V/V）复溶，14 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清进样分析。每组另取样本适量，等量混合为质控（Quality control，QC）样本。QC样本按照上述方法平行进行制备。
1.3 高效液相色谱条件
样品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统进行分离。流动相：A液为含0.08% FA 25 mmol/L甲酸铵水溶液，B液为0.1% FA乙腈。样品置于4 ℃自动进样器中，柱温40 ℃，流速为250 μL/min，进样量2 μL。相关液相梯度如下：0～12 min，B液从 90%线性变化到70%;12～18 min，B液从70%线性变化到50%;18～25 min，B液从50%线性变化到40%，30.0～30.1 min，B液从40%线性变化到90%;30.1～37.0 min，B液维持在90%。样本队列中每间隔一定数量的样本设置一个 QC 样本，用于检测和评价系统的稳定性及重复性。
1.4 质谱分析
采用5500 QTRAP 质谱仪（AB SCIEX）在正离子模式下进行质谱分析。5500 QTRAP ESI 源条件如下：Source temperature 500 ℃，Ion source gas1（Gas1）：40，Ion source gas2（Gas2）：40，Curtain gas（CUR）：30，Ion sapary voltage floating（ISVF）5500 V;采用多反应监测模式检测待测离子对。
1.5 数据处理
采用Multiquant软件提取色谱峰面积及保留时间。采用氨基酸及其衍生物的标准品矫正保留时间，进行代谢物鉴定。
2 结果与分析
2.1 △gidA缺失菌株与野生菌株SC19氨基酸及其衍生物多反应监测结果
样本中共检测到23种氨基酸及其衍生物，以△gidA与SC19定量比较，其中精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、肌酸酐以及鸟氨酸具有显著差异（P<0.05，倍数差异>1.2），其中精氨酸上调约4倍，天冬酰胺下调约17倍，详细定量数据见表1。
2.2 氨基酸代谢组聚类分析
为了评价候选氨基酸的合理性，同时更全面直观地显示样本之间的关系以及氨基酸在不同样本中的表达模式差异，利用定性的显著性差异氨基酸的表达量对各组样本进行层次聚类分析，结果见图1。由图1可见，精氨酸上调显著，天冬酰胺下调显著（红色代表显著性上调氨基酸，蓝色代表显著性下调氨基酸）。 2.3 系統稳定性评价
所有样品等量混合制备成为QC样本，采用QC样本对实验过程仪器系统的稳定性和重复性进行评价。结果见图2。由图2可见，检测氨基酸及其衍生物在QC样本中相对标准偏差小于30%，说明实验过程仪器系统稳定、数据可靠。
3 小结与讨论
氨基酸对于维持细菌正常的生理功能至关重要，氨基酸代谢的异常对细菌的适应性、耐药性及致病性影响重大[5]。细菌在宿主体内对酸性环境的耐受性与存活、定殖、感染、组织炎症反应密切相关，而精氨酸代谢途径通过产生氨来增强细菌对酸性环境的适应性，并且已有文献证实精氨酸代谢途径与细菌的致病性有关[6-8]。Khoury 等[9]研究发现，在补充谷氨酰胺以后，肺炎链球菌在青霉素作用下的存活率提高，表明谷氨酰胺降低了细菌对青霉素的敏感性。猪链球菌是一种人畜共患病原菌，根据荚膜多糖的差异，可分为33个血清型，其中2型是毒力最强的优势血清型[10]，然而猪链球菌2型的氨基酸代谢研究尚未见有人涉及。本研究采用靶向氨基酸代谢组学技术，分析了tRNA修饰酶GidA对猪链球菌氨基酸代谢谱的影响，筛选到精氨酸、天冬酰胺等显著改变的氨基酸，揭示了GidA调控氨基酸代谢的规律，为猪链球菌致病性的解析以及防控提供了理论依据。
参考文献：
[1] CHEN T M， WANG C C， HU L L， et al. Evaluation of the immun-oprotective effects of IF-2 GTPase and SSU05-1022 as a candidate for a Streptococcus suis subunit vaccine[J]. Future microbiology， 2021，16（10）：721-729.
[2] DENICH L， FARZAN A， FRIENDSHIP R， et al. Study of the relationship between untypable and typable isolates of Streptococcus suis recovered from clinically ill and healthy nursery pigs[J]. Veterinary microbiology， 2021， 257：109064.
[3] TAN M F， HU Q， HU Z， et al. Streptococcus suis MsmK：Novel Cell Division Protein Interacting with FtsZ and Maintaining Cell Shape[J]. mSphere，2021， 6（2）：e00119-121.
[4] 高 婷，袁芳艳，刘泽文，等.tRNA修饰酶GidA家族蛋白研究进展[J].动物医学进展，2019，40（5）：98-101.
[5]黄璐璐，谷宇锋，吴翠蓉，等.细菌的应激反应和生理代谢与耐药性及其控制策略[J].生物工程学报，2020，36（11）：2287-2297.
[6] FULDE M， WILLENBORG J， DE GREEFF A， et al. ArgR is an essential local transcriptional regulator of the arcABC operon in Streptococcus suis and is crucial for biological fitness in an acidic environment[J]. Microbiology （Reading， England）， 2011， 157（Pt 2）：572-582.
[7] FULDE M， WILLENBORG J， HUBER C， et al. The arginine-ornithine antiporter ArcD contributes to biological fitness of Streptococcus suis[J]. Frontiers in cellular and infection microbiology， 2014， 4：107.
[8] CHOI Y， CHOI J， GROISMAN E A， et al. Expression of STM4467-encoded arginine deiminase controlled by the STM4463 regulator contributes to Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence[J]. Infection and immunity， 2012， 80（12）：4291-4297.
[9] EI KHOURY J Y， BOUCHER N， BERGERON M G， et al. Penicillin induces alterations in glutamine metabolism in Streptococcus pneumoniae[J]. Scientific reports， 2017， 7（1）：14587.
[10] GAO T， YUAN F Y， LIU Z W， et al. Proteomic and metabolomic analyses provide insights into the mechanism on arginine metabolism regulated by tRNA modification enzymes GidA and MnmE of Streptococcus suis[J]. Frontiers in cellular and infection microbiology， 2020， 10：597408.
关键词：猪链球菌;tRNA修饰酶;GidA;氨基酸代谢
中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章編号：1007-273X（2021）07-0010-03
猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是一种重要的人兽共患传染病病原菌，不仅感染猪还感染人，严重时导致败血症型休克甚至死亡，给养猪业造成重大的经济损失，也威胁着人类的身体健康和生命安全[1-3]。tRNA修饰酶葡萄糖抑制分裂蛋白A（Glucose inhibited division protein A，GidA）是全局性的调控因子，对细菌的生长以及致病性具有重要的调控作用[4]，然而GidA蛋白对猪链球菌的氨基酸代谢谱的影响尚未见文献报道。本研究利用多反应监测技术，以标准品为参照，对特定氨基酸代谢物群进行有针对性、特异性的检测与分析，发现GidA对猪链球菌的氨基酸代谢谱产生了严重的扰动，尤其是精氨酸，而精氨酸代谢又与猪链球菌致病性相关。毒力因子ADS 是精氨酸代谢的重要途径，广泛存在于原核生物体内。ADS主要由精氨酸脱亚氨ArcA、ArcB 和ArcC 3种核心酶组成，通过上述核心酶的作用最终将精氨酸催化降解生成鸟氨酸、二氧化碳、氨和ATP，为细菌提供能量以及增强细菌对酸性环境的适应性。因此，本研究为猪链球菌致病性的解析以及防控提供了新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验仪器和试剂
试验仪器：5500 QTRAP质谱仪（AB SCIEX），Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统，低温高速离心机（Eppendorf 5430R），色谱柱Zic-HILIC 3.5 ?m，2.1 mm×150 mm Column。
试剂：甲酸（Fluka，06450），乙腈（Merck，1499230-935），甲醇（Merck，144282），所有氨基酸及其衍生物的标准品均购自Sigma-Aldrich。
1.2 代谢物提取
取细菌菌体样本，每个样本中加入1 mL 预冷甲醇/乙腈/水（2∶2∶1，V/V/V），转移至1.5 mL离心管中，涡旋混合，冰浴中超声30 min，-20 ℃孵育1 h用于沉淀蛋白，14 000 r/min 4 ℃离心20 min，取上清，真空干燥。质谱检测时加入100 μL乙腈-水溶液（1∶1，V/V）复溶，14 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清进样分析。每组另取样本适量，等量混合为质控（Quality control，QC）样本。QC样本按照上述方法平行进行制备。
1.3 高效液相色谱条件
样品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统进行分离。流动相：A液为含0.08% FA 25 mmol/L甲酸铵水溶液，B液为0.1% FA乙腈。样品置于4 ℃自动进样器中，柱温40 ℃，流速为250 μL/min，进样量2 μL。相关液相梯度如下：0～12 min，B液从 90%线性变化到70%;12～18 min，B液从70%线性变化到50%;18～25 min，B液从50%线性变化到40%，30.0～30.1 min，B液从40%线性变化到90%;30.1～37.0 min，B液维持在90%。样本队列中每间隔一定数量的样本设置一个 QC 样本，用于检测和评价系统的稳定性及重复性。
1.4 质谱分析
采用5500 QTRAP 质谱仪（AB SCIEX）在正离子模式下进行质谱分析。5500 QTRAP ESI 源条件如下：Source temperature 500 ℃，Ion source gas1（Gas1）：40，Ion source gas2（Gas2）：40，Curtain gas（CUR）：30，Ion sapary voltage floating（ISVF）5500 V;采用多反应监测模式检测待测离子对。
1.5 数据处理
采用Multiquant软件提取色谱峰面积及保留时间。采用氨基酸及其衍生物的标准品矫正保留时间，进行代谢物鉴定。
2 结果与分析
2.1 △gidA缺失菌株与野生菌株SC19氨基酸及其衍生物多反应监测结果
样本中共检测到23种氨基酸及其衍生物，以△gidA与SC19定量比较，其中精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、肌酸酐以及鸟氨酸具有显著差异（P<0.05，倍数差异>1.2），其中精氨酸上调约4倍，天冬酰胺下调约17倍，详细定量数据见表1。
2.2 氨基酸代谢组聚类分析
为了评价候选氨基酸的合理性，同时更全面直观地显示样本之间的关系以及氨基酸在不同样本中的表达模式差异，利用定性的显著性差异氨基酸的表达量对各组样本进行层次聚类分析，结果见图1。由图1可见，精氨酸上调显著，天冬酰胺下调显著（红色代表显著性上调氨基酸，蓝色代表显著性下调氨基酸）。 2.3 系統稳定性评价
所有样品等量混合制备成为QC样本，采用QC样本对实验过程仪器系统的稳定性和重复性进行评价。结果见图2。由图2可见，检测氨基酸及其衍生物在QC样本中相对标准偏差小于30%，说明实验过程仪器系统稳定、数据可靠。
3 小结与讨论
氨基酸对于维持细菌正常的生理功能至关重要，氨基酸代谢的异常对细菌的适应性、耐药性及致病性影响重大[5]。细菌在宿主体内对酸性环境的耐受性与存活、定殖、感染、组织炎症反应密切相关，而精氨酸代谢途径通过产生氨来增强细菌对酸性环境的适应性，并且已有文献证实精氨酸代谢途径与细菌的致病性有关[6-8]。Khoury 等[9]研究发现，在补充谷氨酰胺以后，肺炎链球菌在青霉素作用下的存活率提高，表明谷氨酰胺降低了细菌对青霉素的敏感性。猪链球菌是一种人畜共患病原菌，根据荚膜多糖的差异，可分为33个血清型，其中2型是毒力最强的优势血清型[10]，然而猪链球菌2型的氨基酸代谢研究尚未见有人涉及。本研究采用靶向氨基酸代谢组学技术，分析了tRNA修饰酶GidA对猪链球菌氨基酸代谢谱的影响，筛选到精氨酸、天冬酰胺等显著改变的氨基酸，揭示了GidA调控氨基酸代谢的规律，为猪链球菌致病性的解析以及防控提供了理论依据。
参考文献：
[1] CHEN T M， WANG C C， HU L L， et al. Evaluation of the immun-oprotective effects of IF-2 GTPase and SSU05-1022 as a candidate for a Streptococcus suis subunit vaccine[J]. Future microbiology， 2021，16（10）：721-729.
[2] DENICH L， FARZAN A， FRIENDSHIP R， et al. Study of the relationship between untypable and typable isolates of Streptococcus suis recovered from clinically ill and healthy nursery pigs[J]. Veterinary microbiology， 2021， 257：109064.
[3] TAN M F， HU Q， HU Z， et al. Streptococcus suis MsmK：Novel Cell Division Protein Interacting with FtsZ and Maintaining Cell Shape[J]. mSphere，2021， 6（2）：e00119-121.
[4] 高 婷，袁芳艳，刘泽文，等.tRNA修饰酶GidA家族蛋白研究进展[J].动物医学进展，2019，40（5）：98-101.
[5]黄璐璐，谷宇锋，吴翠蓉，等.细菌的应激反应和生理代谢与耐药性及其控制策略[J].生物工程学报，2020，36（11）：2287-2297.
[6] FULDE M， WILLENBORG J， DE GREEFF A， et al. ArgR is an essential local transcriptional regulator of the arcABC operon in Streptococcus suis and is crucial for biological fitness in an acidic environment[J]. Microbiology （Reading， England）， 2011， 157（Pt 2）：572-582.
[7] FULDE M， WILLENBORG J， HUBER C， et al. The arginine-ornithine antiporter ArcD contributes to biological fitness of Streptococcus suis[J]. Frontiers in cellular and infection microbiology， 2014， 4：107.
[8] CHOI Y， CHOI J， GROISMAN E A， et al. Expression of STM4467-encoded arginine deiminase controlled by the STM4463 regulator contributes to Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence[J]. Infection and immunity， 2012， 80（12）：4291-4297.
[9] EI KHOURY J Y， BOUCHER N， BERGERON M G， et al. Penicillin induces alterations in glutamine metabolism in Streptococcus pneumoniae[J]. Scientific reports， 2017， 7（1）：14587.
[10] GAO T， YUAN F Y， LIU Z W， et al. Proteomic and metabolomic analyses provide insights into the mechanism on arginine metabolism regulated by tRNA modification enzymes GidA and MnmE of Streptococcus suis[J]. Frontiers in cellular and infection microbiology， 2020， 10：597408.