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摘要：驴具有很大的市场开发潜力和价值。通过生物信息学技术分析了驴基因的氨基酸序列特征，以期为阿胶原材料的鉴定或阿胶用驴的选育提供科学依据。经分析发现驴基因的氨基酸构成富含大量的甘氨酸和脯氨酸，而色氨酸含量很低。氨基酸序列开头的22个残基预测为该肽链的信号肽区域，COL1A1蛋白中存在大量的卷曲螺旋。驴和马该基因（剔除gap）mRNA序列间存在12处变异，氨基酸序列间只发现1处替换。提示在做原材料鉴定时，若以该基因为分子标记，应着重检测DNA间的差异。
关键词：驴；马；基因；比较分析
中图分类号： S822.2文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）10-0042-03
养驴业是我国畜牧业的重要组成部分，在国民经济及人民生活中具有重要地位。虽然随着交通运输业的发展和农业机械化的普及，驴的役用价值逐渐消失了，伴随而来的是驴群数量减少和种质下滑[1-2]。在全国的大部分地区，驴的种群变化趋势大致如此，但在内蒙古自治区赤峰地区，养驴业已明显向肉用和药用（阿胶）这2个发展方向过渡，养驴业仍是当地农村发展经济的重要组成部分。
胶原蛋白（也称胶原，collagen）是细胞外基质的一种结构蛋白质，为多糖蛋白，约占胶原纤维固体物的85%。胶原蛋白是动物体中普遍存在的一种大分子蛋白，主要存在于动物的结缔组织（骨、软骨、皮肤、肌腱、韧带等）中，占哺乳动物体内蛋白质的25%～30%，相当于体质量的6%[3-4]。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，比如低抗原性、在体内易被人体吸收、能促进细胞成活与生长、促进血小板凝集等，在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。中国传统的胶原保健品“东阿阿胶”主要是以驴皮为原料（其实主要就是驴皮中所含的胶原蛋白）经特殊工艺生产出来的，具有较好的滋补保健作用[5]。
胶原蛋白种类较多，常见类型为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅺ型。Ⅰ型胶原蛋白广泛分布于动物的肌肉、皮肤等组织中，是动物体内含量最丰富的胶原蛋白成分，具有调控胶原纤维形成、组织分化、损伤修复等多种功能。部分学者发现Ⅰ型胶原蛋白的主要成分α1链（COL1A1）在损伤组织修复过程中具有重要的生物学功能[6]。
人类基因（编码Ⅰ型胶原蛋白3股螺旋链中的2股）是骨相关疾病和群体骨自然变异检测的首选基因[7]，这是因为首先该基因的突变被证明与骨质疏松、成骨不全（OI）等骨病的发生有关[8-9]；其次，有研究发现，基因与骨强度（以骨矿物质密度来度量）相关[10-12]。[JP 1]对于驴基因的研究，仅有Lian等的相关报道[6]。为此，本研究通过生物信息学技术初步比较分析驴和马基因的序列特征，为阿胶原材料的鉴定或者阿胶用驴的选育提供科学依据。[JP]
1材料与方法
1.1数据来源
所用的驴和马基因序列，全部来自GenBank。驴和马的登录号分别为FJ594763、XM_005597481。
1.2分析方法
通过DNAMAN 7.0软件完成所有分析。
2结果与分析
2.1驴COL1A1蛋白氨基酸构成分析
通过对驴的COL1A1蛋白氨基酸组成进行分析发现，氨基酸序列长度为1 463个氨基酸残基。从氨基酸构成来看，驴的COL1A1中氨基酸以甘氨酸所占比例最高（出现388次，26.52%），其次為脯氨酸（出现278次，19%），最低的为色氨酸（出现6次，0.41%），具体见表1。
预计驴COL1A1氨基酸序列的等电点（pI）为5.55。
2.2驴COL1A1氨基酸序列信号肽预测
通过DNAMAN 7.0对驴COL1A1氨基酸序列进行信号肽序列预测，结果发现在氨基酸序列开头的前22个氨基酸残基构成的序列信号肽的信号强度最大，估计此段序列为驴COL1A1的信号肽序列（图1）。
2.3驴COL1A1蛋白氨基酸序列二级结构预测
对驴COL1A1蛋白氨基酸序列的二级结构进行预测，发现序列中存在大量的卷曲（coiled-coil），而另2种二级结构——螺旋（helices）和折叠（strands）出现的概率很小（图2）。
2.4驴和马 mRNA序列和编码氨基酸序列比对分析[HT]
通过DNAMAN 7.0软件的多重比对功能，对驴和马的mRNA序列和编码氨基酸序列进行了比对分析。结果发现，除去马的登录序列中的gap区段，mRNA序列中存在12处变异，而氨基酸序列间仅出现1个在驴中是A而在马中是G的替换，结果见图3。
3讨论与结论
由表1可知，驴的COL1A1中氨基酸以甘氨酸所占比例最高，这是因为动物的胶原蛋白都是由3条α肽链形成的3股螺旋，而形成3股螺旋须要有大量甘氨酸的存在[3]。在胶原蛋白的肽链上每3个氨基酸就有1个甘氨酸，形成Gly-X-Y重复区域，X和Y经常是脯氨酸或4-羟脯氨酸[3]，这也可以解释脯氨酸的含量为何是第二大的。
信号肽能够引导蛋白质跨膜转移到特定亚细胞结构或分泌至胞外。信号肽一般包含3个区，N端带正电荷；中间是主要功能区，以中性氨基酸为主，能形成α螺旋；C端含小分子氨基酸，带负电荷，是信号序列切割位点。具备以上3个区，且位于分泌蛋白的N端，才能够形成信号肽。通过DNAMAN7.0对驴COL1A1氨基酸序列进行信号肽序列预测，结果发现在氨基酸序列开头的前22个氨基酸残基构成的序列信号肽信号强度最大，估计此段序列为驴COL1A1的信号肽序列。
对驴COL1A1氨基酸序列的二级结构进行预测，发现序列中存在大量的卷曲（coiled-coil），而另2种二级结构螺旋和折叠出现的概率很小。卷曲螺旋是由2股或2股以上α螺旋相互缠绕形成的超螺旋结构。而在驴以COL1A1蛋白作为主要成分的胶原蛋白中，的确存在大量这种螺旋结构，这也很好地支持了本研究的预测结果。 通过DNAMAN 7.0软件的多重比对功能，对驴和马的mRNA序列和编码氨基酸序列进行了比对分析。结果发现，除去马的登录序列中的gap区段，mRNA序列中存在12处变异；而氨基酸序列间仅出现1个，为在驴中是A而在马中是G的替换。因为在所有动物中，都是一个保守基因，其序列本来就很少发生变化，在驴和马亲缘关系较近的物种对间，这种较小差异的出现也在情理之中。这也提示在做阿胶原材料鉴定时，以DNA为材料可能比以蛋白为材料更准确和灵敏。
参考文献：
[1]Chen J X，Song Z H，Rong M J，et al. The association analysis between Cytb polymorphism and growth traits in three Chinese donkey breeds[J]. Livestock Science，2009，126：306-309.
[2]孙玉江，陈建兴，李新. 发展我国肉驴产业的对策[J]. 当代畜牧，2007（8）：2-4.
[3]Gelse K，Poschl E，Collagens-structure A T，et al. And biosynthesis[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2003，55：1531-1546.
[4]Viguet-carrin S，Garnero P，Delmas P D. The role of collagen in bone strength[J]. Osteoporosis International，2006，17（3）：319-336.[JP]
[5]張少权. 阿胶原料的主要蛋白组成及其生理活性的研究[D]. 福州：福州大学，2005：1-14.
[6]Lian J，Qin Y，You J，et al. Molecular cloning of full-length coding sequences and characterization of α chains for donkey（Equus asinus）type Ⅰ collagen[J]. African Journal of Biotechnology，2013，12（27）：4290-4302.
[7]Stover D A，Verrelli B C. Comparative vertebrate evolutionary analyses of type Ⅰ collagen：potential of gene structure and intron variation for common bone-related diseases[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（1）：533-542.[HJ1.7mm]
[8]Parker M J，Deshpande C，Rankin J，et al. Type 1 collagenopathy presenting with a Russell-Silver phenotype[J]. American Journal of Medical Genetics Part A，2011，155A（6）：1414-1418.
[9]Malfait F，Symoens S，de Backer J，et al. Three arginine to cysteine substitutions in the pro-alpha （Ⅰ）-collagen chain cause Ehlers-Danlos syndrome with a propensity to arterial rupture in early adulthood[J]. Human Mutation，2007，28（4）：387-395.
[10]Garcia-Giralt N，Nogués X，Enjuanes Anna，et al. Two new single-nucleotide polymorphisms in the upstream regulatory region and their relationship to bone mineral density[J]. Journal of Bone and Mineral Research，2002，17（3）：384-393.
[11]Stewart T L，Jin Huilin，Mcguigan F E，et al. Haplotypes defined by promoter and intron 1 polymorphisms of the gene regulate bone mineral density in women[J]. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，2006，91（9）：3575-3583.
[12]Jiang H，Lei S F，Xiao S M，et al. Association and linkage analysis of and [WTBX][STBX]AHSG[WTBZ][STBZ] gene polymorphisms with femoral neck bone geometric parameters in both Caucasian and Chinese nuclear families[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2007，28（3）：375-381.
关键词：驴；马；基因；比较分析
中图分类号： S822.2文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）10-0042-03
养驴业是我国畜牧业的重要组成部分，在国民经济及人民生活中具有重要地位。虽然随着交通运输业的发展和农业机械化的普及，驴的役用价值逐渐消失了，伴随而来的是驴群数量减少和种质下滑[1-2]。在全国的大部分地区，驴的种群变化趋势大致如此，但在内蒙古自治区赤峰地区，养驴业已明显向肉用和药用（阿胶）这2个发展方向过渡，养驴业仍是当地农村发展经济的重要组成部分。
胶原蛋白（也称胶原，collagen）是细胞外基质的一种结构蛋白质，为多糖蛋白，约占胶原纤维固体物的85%。胶原蛋白是动物体中普遍存在的一种大分子蛋白，主要存在于动物的结缔组织（骨、软骨、皮肤、肌腱、韧带等）中，占哺乳动物体内蛋白质的25%～30%，相当于体质量的6%[3-4]。胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，比如低抗原性、在体内易被人体吸收、能促进细胞成活与生长、促进血小板凝集等，在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用。中国传统的胶原保健品“东阿阿胶”主要是以驴皮为原料（其实主要就是驴皮中所含的胶原蛋白）经特殊工艺生产出来的，具有较好的滋补保健作用[5]。
胶原蛋白种类较多，常见类型为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅺ型。Ⅰ型胶原蛋白广泛分布于动物的肌肉、皮肤等组织中，是动物体内含量最丰富的胶原蛋白成分，具有调控胶原纤维形成、组织分化、损伤修复等多种功能。部分学者发现Ⅰ型胶原蛋白的主要成分α1链（COL1A1）在损伤组织修复过程中具有重要的生物学功能[6]。
人类基因（编码Ⅰ型胶原蛋白3股螺旋链中的2股）是骨相关疾病和群体骨自然变异检测的首选基因[7]，这是因为首先该基因的突变被证明与骨质疏松、成骨不全（OI）等骨病的发生有关[8-9]；其次，有研究发现，基因与骨强度（以骨矿物质密度来度量）相关[10-12]。[JP 1]对于驴基因的研究，仅有Lian等的相关报道[6]。为此，本研究通过生物信息学技术初步比较分析驴和马基因的序列特征，为阿胶原材料的鉴定或者阿胶用驴的选育提供科学依据。[JP]
1材料与方法
1.1数据来源
所用的驴和马基因序列，全部来自GenBank。驴和马的登录号分别为FJ594763、XM_005597481。
1.2分析方法
通过DNAMAN 7.0软件完成所有分析。
2结果与分析
2.1驴COL1A1蛋白氨基酸构成分析
通过对驴的COL1A1蛋白氨基酸组成进行分析发现，氨基酸序列长度为1 463个氨基酸残基。从氨基酸构成来看，驴的COL1A1中氨基酸以甘氨酸所占比例最高（出现388次，26.52%），其次為脯氨酸（出现278次，19%），最低的为色氨酸（出现6次，0.41%），具体见表1。
预计驴COL1A1氨基酸序列的等电点（pI）为5.55。
2.2驴COL1A1氨基酸序列信号肽预测
通过DNAMAN 7.0对驴COL1A1氨基酸序列进行信号肽序列预测，结果发现在氨基酸序列开头的前22个氨基酸残基构成的序列信号肽的信号强度最大，估计此段序列为驴COL1A1的信号肽序列（图1）。
2.3驴COL1A1蛋白氨基酸序列二级结构预测
对驴COL1A1蛋白氨基酸序列的二级结构进行预测，发现序列中存在大量的卷曲（coiled-coil），而另2种二级结构——螺旋（helices）和折叠（strands）出现的概率很小（图2）。
2.4驴和马 mRNA序列和编码氨基酸序列比对分析[HT]
通过DNAMAN 7.0软件的多重比对功能，对驴和马的mRNA序列和编码氨基酸序列进行了比对分析。结果发现，除去马的登录序列中的gap区段，mRNA序列中存在12处变异，而氨基酸序列间仅出现1个在驴中是A而在马中是G的替换，结果见图3。
3讨论与结论
由表1可知，驴的COL1A1中氨基酸以甘氨酸所占比例最高，这是因为动物的胶原蛋白都是由3条α肽链形成的3股螺旋，而形成3股螺旋须要有大量甘氨酸的存在[3]。在胶原蛋白的肽链上每3个氨基酸就有1个甘氨酸，形成Gly-X-Y重复区域，X和Y经常是脯氨酸或4-羟脯氨酸[3]，这也可以解释脯氨酸的含量为何是第二大的。
信号肽能够引导蛋白质跨膜转移到特定亚细胞结构或分泌至胞外。信号肽一般包含3个区，N端带正电荷；中间是主要功能区，以中性氨基酸为主，能形成α螺旋；C端含小分子氨基酸，带负电荷，是信号序列切割位点。具备以上3个区，且位于分泌蛋白的N端，才能够形成信号肽。通过DNAMAN7.0对驴COL1A1氨基酸序列进行信号肽序列预测，结果发现在氨基酸序列开头的前22个氨基酸残基构成的序列信号肽信号强度最大，估计此段序列为驴COL1A1的信号肽序列。
对驴COL1A1氨基酸序列的二级结构进行预测，发现序列中存在大量的卷曲（coiled-coil），而另2种二级结构螺旋和折叠出现的概率很小。卷曲螺旋是由2股或2股以上α螺旋相互缠绕形成的超螺旋结构。而在驴以COL1A1蛋白作为主要成分的胶原蛋白中，的确存在大量这种螺旋结构，这也很好地支持了本研究的预测结果。 通过DNAMAN 7.0软件的多重比对功能，对驴和马的mRNA序列和编码氨基酸序列进行了比对分析。结果发现，除去马的登录序列中的gap区段，mRNA序列中存在12处变异；而氨基酸序列间仅出现1个，为在驴中是A而在马中是G的替换。因为在所有动物中，都是一个保守基因，其序列本来就很少发生变化，在驴和马亲缘关系较近的物种对间，这种较小差异的出现也在情理之中。这也提示在做阿胶原材料鉴定时，以DNA为材料可能比以蛋白为材料更准确和灵敏。
参考文献：
[1]Chen J X，Song Z H，Rong M J，et al. The association analysis between Cytb polymorphism and growth traits in three Chinese donkey breeds[J]. Livestock Science，2009，126：306-309.
[2]孙玉江，陈建兴，李新. 发展我国肉驴产业的对策[J]. 当代畜牧，2007（8）：2-4.
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[4]Viguet-carrin S，Garnero P，Delmas P D. The role of collagen in bone strength[J]. Osteoporosis International，2006，17（3）：319-336.[JP]
[5]張少权. 阿胶原料的主要蛋白组成及其生理活性的研究[D]. 福州：福州大学，2005：1-14.
[6]Lian J，Qin Y，You J，et al. Molecular cloning of full-length coding sequences and characterization of α chains for donkey（Equus asinus）type Ⅰ collagen[J]. African Journal of Biotechnology，2013，12（27）：4290-4302.
[7]Stover D A，Verrelli B C. Comparative vertebrate evolutionary analyses of type Ⅰ collagen：potential of gene structure and intron variation for common bone-related diseases[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（1）：533-542.[HJ1.7mm]
[8]Parker M J，Deshpande C，Rankin J，et al. Type 1 collagenopathy presenting with a Russell-Silver phenotype[J]. American Journal of Medical Genetics Part A，2011，155A（6）：1414-1418.
[9]Malfait F，Symoens S，de Backer J，et al. Three arginine to cysteine substitutions in the pro-alpha （Ⅰ）-collagen chain cause Ehlers-Danlos syndrome with a propensity to arterial rupture in early adulthood[J]. Human Mutation，2007，28（4）：387-395.
[10]Garcia-Giralt N，Nogués X，Enjuanes Anna，et al. Two new single-nucleotide polymorphisms in the upstream regulatory region and their relationship to bone mineral density[J]. Journal of Bone and Mineral Research，2002，17（3）：384-393.
[11]Stewart T L，Jin Huilin，Mcguigan F E，et al. Haplotypes defined by promoter and intron 1 polymorphisms of the gene regulate bone mineral density in women[J]. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism，2006，91（9）：3575-3583.
[12]Jiang H，Lei S F，Xiao S M，et al. Association and linkage analysis of and [WTBX][STBX]AHSG[WTBZ][STBZ] gene polymorphisms with femoral neck bone geometric parameters in both Caucasian and Chinese nuclear families[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2007，28（3）：375-381.