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【摘 要】目的：探讨罗氏总蛋白双缩脲法直接检测高浓度尿蛋白（>2.0g/l尿蛋白）可行性。方法：收集患者尿蛋白浓度为2.0-30g/l的尿液标本以及稀释标准品，分别用邻苯三酚红钼法和双缩脲方法在Olympus AU5400和罗氏c8000生化仪上测定进行比较。 结果：邻苯三酚红钼法和双缩脲法测三种不同浓度尿蛋白重复性实验cv<6%。蛋白浓度>15g/l时，双缩脲法cv小于邻苯三酚红钼法。双缩脲法在罗氏c8000自动生化分析仪线性观察Y=0.8725X+0.5537 （r2=0.9904），r2>0.975表明呈相关。二种方法检测r2>0.975表明呈线性相关，配对t检验t=-0.812，p=0.422，p>0.05无明显差异。结论：罗氏c8000自动生化分析仪及配套总蛋白双缩脲检测试剂可用于直接测定>2g/l的尿蛋白，无需对样本进行稀释处理，是一种简单快速、准确的方法，能够满足临床要求。
【关键词】邻苯三酚红钼法；双缩脲法；尿蛋白
尿蛋白测定是肾脏疾病诊断和检测的常用指标，邻苯三酚红钼法是目前常用的检测方法，按照NCCLS关于线性试验的评价方案进行。结果表明尿蛋白在2.1g/L至15.3g/L内线性良好（G2.0g/l的尿蛋白，以探讨双缩脲法直接检测高浓度尿蛋白的准确性。
1 材料和方法：
1.1 标本 收集住院患者尿蛋白浓度>2.0g/l尿标本10ml，3000 r/min离心10分钟，取上清液，排除乳糜尿，药物等因素的影响。
1.2 标准品 罗氏c.f.a.s标准品。
1.3 仪器 日本产Olympus AU5400自动生化分析仪和德国产罗氏c8000自动生化分析仪。
1.4 试剂 邻苯三酚红钼法（宁波美康生物科技股份有限公司），线性范围0-2.0g/l，>2.0g/l的标本需稀释；双缩脲法检测试剂盒（德国罗氏诊断有限公司），线性范围2.0-120g/l。
1.5方法
1.5.1 生化分析仪参数 Olympus AU5400 邻苯三酚红钼法：方法 一点终点法 ，样品量1.8ul， 试剂量 150ul ，主波长 600nm，次波长 700nm，测光点 27 ； 罗氏c8000 总蛋白检测.双缩脲法：方法 两点终点法 样品量2.0ul， 第1试剂量 90ul，第2试剂量 32ul，主波长 700nm，次波长 546nm ，测定点 18-33 。
1.5.2 收集高浓度（尿蛋白>15g/l），中浓度（尿蛋白>5g/l），低浓度（尿蛋白>2.0g/l）尿标本各一份，分别用邻苯三酚红钼法（尿标本1：10或1：20稀释）和罗氏总蛋白双缩脲检测.法在Olympus AU5400和罗氏c8000自动生化分析仪重复测定20次，计算 、CV、SD。用罗氏c.f..a.s 标准品用生理盐水1：2稀释后分别1：4，1：6，1：8，1：12，1：16，1：24倍比稀释。罗氏总蛋白检测.双缩脲法在自动生化分析仪测定每份浓度测三次，，计算线性和相关度。收集>2.0g/l尿标本40例分成二份分别用Olympus AU5400邻苯三酚红钼法和罗氏c8000总蛋白检测.双缩脲法自动生化分析仪测定，计算相关性。
1.6 统计方法 采用SPSS19版本软件和Excel 2003软件对数据进行分析处理求SD，CV及相关性，显著性检验采用配对t检验。
2 结果：
2.1.1.重复性试验 取浓度1（尿蛋白>15g/l），浓度2 （尿蛋白5.0-15 g /l）和浓度3 （尿蛋白2.0-5.0g/l），分别用罗氏总蛋白双缩脲法在罗氏c8000自动生化分析仪、邻苯三酚红钼法在Olympus AU5400自动生化分析仪测定20次，统计两者 、CV，结果见表1。
2.1.2用罗氏c.f.a.s 标准品（TP=51.1g/l）用生理盐水稀释成浓度4（蛋白25.5g/l），分别用罗氏总蛋白双缩脲法在罗氏c8000自动生化分析仪、邻苯三酚红钼法在Olympus AU5400自动生化分析仪测定20次，统计两者 、CV，结果见表2。
2.2线性观察 用罗氏c.f.a.s 标准品（TP=51.1g/l）用生理盐水稀释成12.75g/l，8.52g/l，6.38g/l，4.26g/l，3.19g/l，2.13g/l六种浓度按操作，结果表明Y=0.8725X+0.5537
（r2=0.9904），r2>0.975表明呈相关。
2.3相关试验 收集>2.0g/l尿标本40例分成二份，分别用二种方法检测，结果表明Y=0.9910X+00309（r2=0.9981），r2>0.975表明呈线性相关，配对t检验t=-0.812，p=0.422，p>0.05说明二种方法无明显差异。
3 討论
尿蛋白是检测肾脏疾病常用指标24h尿蛋白定量在0.15-0.5g之间为微量蛋白尿。在0.5-1.0g之间为轻度蛋白尿，在1-4g之间为中度蛋白尿，大于4g（有学者定为3.5g）为重度蛋白尿[2]。尿蛋白检测方法很多，包括沉淀双缩脲法（TP法），磺柳酸比浊法（SSA），邻苯三酚红钼法（PRM法）等。根据肾脏疾病发展，是各种原发和继发肾小球疾病疗效评价及预后判断的重要指标。尿蛋白的检测受多种因素的影响，至今仍缺乏一个能普遍推广的稳定、准确的标准方法[3]。沉淀双缩脲法是测定尿蛋白较准确的方法，但操作要求较高。有文章报道PRM法与TP法相关性较好[1]。 邻苯三酚红钼法是目前临床上广泛用来测定尿蛋白和脑脊液蛋白浓度的首选方法[4]，具有灵敏度高，重复性好，标本用量少，样本不需要预处理，适用于自动化分析的优点，其不足为线性范围较窄，但可通过机器稀释法，即只要稀释后测定的数值在其线性范围内，也同样能达到精确测定的目的[5]。本次试验我们采用的邻苯三酚红钼法（宁波美康生物科技股份有限公司）说明书线性范围0-3g/l，但实际试验操作线性范围是0-2.0g/l，超过2.0g/l Olympus AU5400生化仪自动将标本1：10稀释，即要稀释后测定的数值要在其线性范围内。而Olympus AU5400生化仪配套总蛋白检测双缩脲法线性范围30-130g/l，无法用于尿蛋白检测，因此我们采用罗氏c8000总蛋白双缩脲法试剂，其检测线性范围2-120g/l，可以用于测定>2.0g/l的尿蛋白[6]。
本次试验结果提示，检测2.0-15 g/l的尿蛋白时，邻苯三酚红钼法和双缩脲法检测结果均较准确。但在检测>15g/l的尿蛋白和蛋白标准品，邻苯三酚红钼法，误差增大，结果明显偏低，而罗氏双缩脲法测定>15g/l的尿蛋白和蛋白标准品时，结果均较准确，其重复试验CV值低于邻苯三酚红钼法。因此，我们认为罗氏c8000自动生化分析仪及配套总蛋白双缩脲法检测试剂可用于直接测定>2g/l的尿蛋白，无需对样本进行稀释处理，是一种简单快速且准确的方法，能够满足临床要求。
参考文献：
[1] 陈筱菲 池胜英 刘存丽 袁谦 吴晓 尿总蛋白测定情况调查和邻苯三酚红钼法评价 [J]温州医学院学报，2004，34（5）：369-370.
[2] 陈香.尿蛋白的检测方法及其重要性 [J].中国医学创新，2010，7（3）：186-187.
[3] 李学旺.尿液蛋白质的检测及临床评价 [J].中国实用内科杂志， 2002，22（1）：17-19.
[4] 叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程（第3版）.北京：中华人民共和国卫生部医政司。2006：342-343.
[5] 苗静，王学晶，徐国宾等.邻苯三酚红钼络合法与双缩脲比色法測定嘌呤霉素肾病大鼠尿中总蛋白浓度的比较.实用医学杂志，2009，25（4）：533-535.
[6] 王时南.两种校准品和3种双缩脲试剂测定血清总蛋白结果偏倚评估及方法学评价.医学研究杂志，2011，40（10）：125-128.
【关键词】邻苯三酚红钼法；双缩脲法；尿蛋白
尿蛋白测定是肾脏疾病诊断和检测的常用指标，邻苯三酚红钼法是目前常用的检测方法，按照NCCLS关于线性试验的评价方案进行。结果表明尿蛋白在2.1g/L至15.3g/L内线性良好（G
1 材料和方法：
1.1 标本 收集住院患者尿蛋白浓度>2.0g/l尿标本10ml，3000 r/min离心10分钟，取上清液，排除乳糜尿，药物等因素的影响。
1.2 标准品 罗氏c.f.a.s标准品。
1.3 仪器 日本产Olympus AU5400自动生化分析仪和德国产罗氏c8000自动生化分析仪。
1.4 试剂 邻苯三酚红钼法（宁波美康生物科技股份有限公司），线性范围0-2.0g/l，>2.0g/l的标本需稀释；双缩脲法检测试剂盒（德国罗氏诊断有限公司），线性范围2.0-120g/l。
1.5方法
1.5.1 生化分析仪参数 Olympus AU5400 邻苯三酚红钼法：方法 一点终点法 ，样品量1.8ul， 试剂量 150ul ，主波长 600nm，次波长 700nm，测光点 27 ； 罗氏c8000 总蛋白检测.双缩脲法：方法 两点终点法 样品量2.0ul， 第1试剂量 90ul，第2试剂量 32ul，主波长 700nm，次波长 546nm ，测定点 18-33 。
1.5.2 收集高浓度（尿蛋白>15g/l），中浓度（尿蛋白>5g/l），低浓度（尿蛋白>2.0g/l）尿标本各一份，分别用邻苯三酚红钼法（尿标本1：10或1：20稀释）和罗氏总蛋白双缩脲检测.法在Olympus AU5400和罗氏c8000自动生化分析仪重复测定20次，计算 、CV、SD。用罗氏c.f..a.s 标准品用生理盐水1：2稀释后分别1：4，1：6，1：8，1：12，1：16，1：24倍比稀释。罗氏总蛋白检测.双缩脲法在自动生化分析仪测定每份浓度测三次，，计算线性和相关度。收集>2.0g/l尿标本40例分成二份分别用Olympus AU5400邻苯三酚红钼法和罗氏c8000总蛋白检测.双缩脲法自动生化分析仪测定，计算相关性。
1.6 统计方法 采用SPSS19版本软件和Excel 2003软件对数据进行分析处理求SD，CV及相关性，显著性检验采用配对t检验。
2 结果：
2.1.1.重复性试验 取浓度1（尿蛋白>15g/l），浓度2 （尿蛋白5.0-15 g /l）和浓度3 （尿蛋白2.0-5.0g/l），分别用罗氏总蛋白双缩脲法在罗氏c8000自动生化分析仪、邻苯三酚红钼法在Olympus AU5400自动生化分析仪测定20次，统计两者 、CV，结果见表1。
2.1.2用罗氏c.f.a.s 标准品（TP=51.1g/l）用生理盐水稀释成浓度4（蛋白25.5g/l），分别用罗氏总蛋白双缩脲法在罗氏c8000自动生化分析仪、邻苯三酚红钼法在Olympus AU5400自动生化分析仪测定20次，统计两者 、CV，结果见表2。
2.2线性观察 用罗氏c.f.a.s 标准品（TP=51.1g/l）用生理盐水稀释成12.75g/l，8.52g/l，6.38g/l，4.26g/l，3.19g/l，2.13g/l六种浓度按操作，结果表明Y=0.8725X+0.5537
（r2=0.9904），r2>0.975表明呈相关。
2.3相关试验 收集>2.0g/l尿标本40例分成二份，分别用二种方法检测，结果表明Y=0.9910X+00309（r2=0.9981），r2>0.975表明呈线性相关，配对t检验t=-0.812，p=0.422，p>0.05说明二种方法无明显差异。
3 討论
尿蛋白是检测肾脏疾病常用指标24h尿蛋白定量在0.15-0.5g之间为微量蛋白尿。在0.5-1.0g之间为轻度蛋白尿，在1-4g之间为中度蛋白尿，大于4g（有学者定为3.5g）为重度蛋白尿[2]。尿蛋白检测方法很多，包括沉淀双缩脲法（TP法），磺柳酸比浊法（SSA），邻苯三酚红钼法（PRM法）等。根据肾脏疾病发展，是各种原发和继发肾小球疾病疗效评价及预后判断的重要指标。尿蛋白的检测受多种因素的影响，至今仍缺乏一个能普遍推广的稳定、准确的标准方法[3]。沉淀双缩脲法是测定尿蛋白较准确的方法，但操作要求较高。有文章报道PRM法与TP法相关性较好[1]。 邻苯三酚红钼法是目前临床上广泛用来测定尿蛋白和脑脊液蛋白浓度的首选方法[4]，具有灵敏度高，重复性好，标本用量少，样本不需要预处理，适用于自动化分析的优点，其不足为线性范围较窄，但可通过机器稀释法，即只要稀释后测定的数值在其线性范围内，也同样能达到精确测定的目的[5]。本次试验我们采用的邻苯三酚红钼法（宁波美康生物科技股份有限公司）说明书线性范围0-3g/l，但实际试验操作线性范围是0-2.0g/l，超过2.0g/l Olympus AU5400生化仪自动将标本1：10稀释，即要稀释后测定的数值要在其线性范围内。而Olympus AU5400生化仪配套总蛋白检测双缩脲法线性范围30-130g/l，无法用于尿蛋白检测，因此我们采用罗氏c8000总蛋白双缩脲法试剂，其检测线性范围2-120g/l，可以用于测定>2.0g/l的尿蛋白[6]。
本次试验结果提示，检测2.0-15 g/l的尿蛋白时，邻苯三酚红钼法和双缩脲法检测结果均较准确。但在检测>15g/l的尿蛋白和蛋白标准品，邻苯三酚红钼法，误差增大，结果明显偏低，而罗氏双缩脲法测定>15g/l的尿蛋白和蛋白标准品时，结果均较准确，其重复试验CV值低于邻苯三酚红钼法。因此，我们认为罗氏c8000自动生化分析仪及配套总蛋白双缩脲法检测试剂可用于直接测定>2g/l的尿蛋白，无需对样本进行稀释处理，是一种简单快速且准确的方法，能够满足临床要求。
参考文献：
[1] 陈筱菲 池胜英 刘存丽 袁谦 吴晓 尿总蛋白测定情况调查和邻苯三酚红钼法评价 [J]温州医学院学报，2004，34（5）：369-370.
[2] 陈香.尿蛋白的检测方法及其重要性 [J].中国医学创新，2010，7（3）：186-187.
[3] 李学旺.尿液蛋白质的检测及临床评价 [J].中国实用内科杂志， 2002，22（1）：17-19.
[4] 叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程（第3版）.北京：中华人民共和国卫生部医政司。2006：342-343.
[5] 苗静，王学晶，徐国宾等.邻苯三酚红钼络合法与双缩脲比色法測定嘌呤霉素肾病大鼠尿中总蛋白浓度的比较.实用医学杂志，2009，25（4）：533-535.
[6] 王时南.两种校准品和3种双缩脲试剂测定血清总蛋白结果偏倚评估及方法学评价.医学研究杂志，2011，40（10）：125-128.