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摘要：花色素苷的合成是红色芒果果实着色的主要代谢途径，类黄酮糖基转移酶（UFGT）是花色素苷合成的最后一个酶，它可以将不稳定的花色素催化成花色素苷。根据已经报道的UFGT基因的序列设计兼并引物，采用3′RACE、5′RACE方法，克隆得到芒果果实UFGT基因的全长cDNA序列。该基因开放阅读框为1 392 bp，编码463个氨基酸，分子量为51.15 ku。对基因组扩增得到2 770 bp长度的片段分析发现，该基因含有2个内含子，分别在501～1 095 bp、1 548～2 330 bp。通过系统发育分析发现，该基因编码的蛋白与荔枝、山竹子等热带果树具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的UFGT基因表达进行分析发现，红色的芒果品种中表达量较高，黄色的芒果品种中表达量较低。
关键词：芒果；花色素苷；UFGT基因；基因克隆
中图分类号： S667.701；Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0031-03
芒果（Mangifera indica）是重要的热带、亚热带果树，其果实颜色多样[1]。芒果果实富含类胡萝卜素、花色素苷等物质，其中花色素苷合成途径是红色芒果果实着色的主要代谢途径。类黄酮糖基转移酶（UFGT）是花色素苷合成的最后一个酶，可以将不稳定的花色素催化成花色素苷。卢其能等[1]、刘海峰等[2]分别从红巴梨果皮、马铃薯以及山葡萄中克隆了UFGT 基因，并且作了表达分析，到目前为止，山竹子（Garcinia mangostana）、草莓（Fragaria×ananassa）、西洋梨（Pyrus communis）、葡萄柚（Citrus×paradisi）、荔枝（Litchi chinensis Sonn.）等果树中的UFGT基因得到了克隆[3-6]。UFGT是花色素苷合成的关键基因。Ju等发现，苹果果实发育过程中，UFGT只在果实接近成熟的转色期表达，表达的强度与花色素苷合成呈正相关[7]。Boss等对白皮葡萄、黑皮葡萄的不同组织进行表达分析发现，UFGT基因只在有色的葡萄果皮中表达[4]。本研究采用RACE方法从芒果的果实中克隆得到了一个UFGT基因，探讨该基因在芒果果实花色素苷合成的作用机制及其对果实着色的影响，深入揭示该基因在芒果果实花色素苷生物合成的分子机制，旨在为芒果果实着色提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
以贵妃芒果的果实（取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所的农业部芒果种质资源圃）为试材。大肠杆菌DH5а为本实验室保存，引物合成自英骏生物技术有限公司，DEPC、IPTG、Tryptone、Yeast extract、Amp、X-GaL、pMD-19T载体、Taq DNA 聚合酶、dNTP、T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶均购于大连宝生物公司。
1.2方法
参照王家保等所述的方法[5]提取芒果DNA，用无菌的双蒸水溶解，采用核酸蛋白测定仪进行测定，-20 ℃保存备用。采用天根总RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取芒果总RNA，用RNase-free无菌水溶解，用大连宝生物公司的DNase试剂盒进行DNA去除，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和DNA是否去除干净，并用核酸蛋白测定仪对所得RNA的D260 nm/D230 nm、D260 nm/D280 nm及浓度进行测定，用TaKaRa公司的3′和5′-RACE 试剂盒进行目的基因的3′、5′转录。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；95 ℃变性50 s，50 ℃复性50 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸7 min；反应体系为25 μL，其中含10×PCR buffer （含Mg2 ） 2.5 μL、25 ng/μL DNA模板2.0 μL、20 μmol引物各1.0 μL、2.5 U/μL Taq DNA聚合酶0.4 μL、5.0 mmol/L dNTPs 2.0 μL；反应体系在eppendor PCR仪上扩增，扩增反应结束后取10 μL进行扩增产物的电泳，采用gelred染色后在紫外凝胶成像仪上观察、拍照分析。
1.3UFGT基因全长cDNA和基因组DNA序列的获得
以贵妃芒果的果实总RNA作为模板，采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit （Clontech）反转录合成第一链cDNA，并参照该试剂盒的说明书进行cDNA 3′ 端和5′末端cDNA的扩增。根据cDNA片段的测序结果，分别设计2条上游引物，以接头为锚定引物进行半巢式PCR反应。将3′ 端和5′末端的PCR反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，确定所得到的片段大小是否与预测的片段大小一致。目的基因片段回收、连接、转化、鉴定及测序，并根据已知的片段和得到的cDNA 3′ 端和5′末端的序列结果拼接该基因的全长 cDNA。以上述cDNA和提取的基因组DNA为模板，设计特异引物，进行全长cDNA和基因组DNA序列扩增反应，PCR反应体系25 μL，从中取6 μL PCR产物加入0.2 mL PCR管中，加入1 μL 6×Loading Buffer，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增的片段大小是否正确。确定PCR产物中含有所需大小的目的片段一致后，对PCR产物进行普通琼脂糖凝胶电泳，用手术刀在紫外灯下切下含有目的片段胶块，再用DNA凝胶回收试剂盒（Agarose Gel DNA Purification Kit，TaKaRa公司）进行目的片段回收，参照试剂盒说明书上的步骤进行回收。取5 μL回收纯化后的目的DNA产物进行1.2%琼脂糖电泳检测，以检验回收效果及大致含量，根据回收产物片段大小及其有效浓度，取适量回收纯化的产物与克隆载体pMD19-T（TaKaRa公司）连接，目的DNA与克隆载体的摩尔比控制在3 ∶1左右。反应混合液包括1 μL pMD19-T vector、4 μL 纯化后的DNA、5 μL Ligation solution Ⅰ，混合均匀后在16 ℃ 下恒温水浴过夜连接。 1.4UFGT基因氨基酸序列的结构特征和分子进化的分析
将所扩增得到的全长序列进行NCBI序列比对，确定该基因是否为UFGT基因，并进行其他物种UFGT基因的比对，采用DNAMAN软件分析基因核苷酸和氨基酸的结构特征和同源性，分析该基因所推定氨基酸序列，进行多序列比较并构建系统树。
1.5表达分析
分别提取不同芒果品种的RNA，反转为cDNA 并采用Primer 5.0设计引物进行RT-PCR扩增。RT-PCR分析采用内参引物actin-F：5′-AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC-3′和actin-R：5′- TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA-3′。目的基因扩增采用引物UFGT-F：5′-CAGCATAGCCCATATAGCACTC-3′和UFGT-R：5′-CAATGGAGCCGATATAAAACTAT-3′，PCR 产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，采用Quantity One 软件进行数据分析，作出相对表达量。
2结果与分析
2.1UFGT基因的获得
根据得到的3′端、5′端序列信息进行拼接，最后得到UFGT基因的全长cDNA序列。设计特异引物进行全长cDNA和基因组DNA序列扩增，电泳结果如图1所示。将电泳条带回收测序后得到的UFGT基因的cDNA全长序列为1 573 bp，分析发现开放阅读框为 1 392 bp，编码463个氨基酸序列（图2）。通过NCBI上已经登录的苹果、草莓、荔枝的UFGT蛋白序列进行比对（图3），发现克隆的基因为UFGT基因。对基因组DNA扩增得到约2 770 bp的片段，通过与cDNA序列比对发现，该基因含有2个内含子，分别位于501～1 095 bp、1 548～2 330 bp之间（图4）。
2.2芒果UFGT基因的部分生物信息学分析
采用DNAMAN进行二级结构的预测，发现芒果UFGT基因蛋白的二级结果主要以无规则卷曲和β-折叠为主，也具有少量的α-螺旋结构（图5）。采用bioedit软件的Kyte 和Doolittle 算法对UFGT蛋白的亲水/疏水性（正值表示疏水性，负值表示亲水性）进行分析，UFGT蛋白所含的氨基酸主要介于 1.3～-3之间（图6），采用DNAMAN软件分析发现，芒果UFGT蛋白与荔枝、山竹子等热带果树的蛋白序列聚为一类。草莓、苹果、桃、西洋梨、樱桃等温带果树可以聚为一类（图7）。
2.3UFGT基因的RT-PCR分析
分别提取不同着色程度的芒果果皮RNA，反转录为 cDNA，通过上述RT-PCR分析的引物进行扩增，对扩增结果进行分析发现：该基因在红色果皮的贵妃的果实中表达较多，绿色果皮中次之，黄皮果皮中相对表达较少（图8），初步推断UFGT基因可能与红色果实的花色素苷合成有密切关系，而黄皮的芒果品种可能与类胡萝卜素合成有密切关系。
3结论与讨论
本研究成功从芒果果实中分离得到了1个全长UFGT基因，该基因的cDNA的开放阅读框为1 392 bp，编码463个氨基酸，对基因组分析发现，该基因含有2个内含子，荔枝的UFGT基因含有1个内含子。通过在线软件对cDNA和蛋白序列分析证实了该序列是植物UFGT基因的一员，也发现其所推导的氨基酸序列含有UDPGT、COG1819、MGT等保守结构域[8]。芒果UFGT基因与所选其他物种UFGT基因序列相比较发现，无论在全长cDNA序列上还是其编码氨基酸序列上都具有较高的保守结构域。同时，通过与其他部分物种的氨基酸序列构建系统发生树发现，芒果UFGT基因编码的蛋白与荔枝、山竹子等热带果树可以聚为一类，草莓、苹果、桃、西洋梨、樱桃等温带果树可以聚为一类。付海辉等采用MEGA 4.1软件对部分植物的UFGT基因分析发现，草莓、葡萄、苹果等可以聚为一类[9]，本研究的结果与其具有一致性。付海辉等预测，部分植物的UFGT基因可能亚细胞定位于液
泡或叶绿体中，在液泡中催化不稳定的花色素转化为稳定的花色素苷，从而使花色素苷在液泡中大量积累[9]。芒果UFGT基因是芒果花色素苷合成代谢途径中的关键基因，它对芒果果皮红色形成具有重要的作用。
参考文献：
[1]卢其能，杨清，沈春修. 马铃薯类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因的克隆与表达分析[J]. 华北农学报，2009，24（4）：11-16.
[2]刘海峰，杨成君，于淼，等. 山葡萄UDP-葡萄糖：类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因（3GT）cDNA的克隆和分析[J]. 植物生理学通讯，2009，45（8）：748-752.
[3]Palapol Y，Ketsa S，Kui L W，et al. A MYB transcription factor regulates anthocyanin biosynthesis in mangosteen （Garcinia mangostana L.） fruit during ripening[J]. Planta，2009，229（6）：1323-1334.
[4]Boss P K，Davies C，Robinson S P. Expression of anthocyanin biosyn
thesis pathway genes in red and white grapes[J]. Plant Molecular Biology，1996，32（3）：565-569.
[5]王家保，王令霞，刘志媛，等. 芒果DNA提取方法比较及ISSR反应体系的优化[J]. 生物技术，2005，15（5）：37-41.
[6]赵志常，胡福初，胡桂兵，等. 荔枝类黄酮糖基转移酶（UFGT）基因的克隆及其原核表达研究[J]. 广西师范大学学报：自然科学版，2011，29（4）：104-110.
[7]Ju Z G，Liu C L，Yuan Y B. Acitivties of chalcone synthase and UDPGal：flavonoid-3-O-glycosyltransferase in relation to anthocyanin synthesis in apple[J]. Scientia Horticulturae，1995，63：175-185.
[8]Castellarin S D，Pfeiffer A，Sivilotti P A，et al. Transcriptional regulation of anthocyanin biosynthesis in ripening fruits of grapevine under seasonal water deficit[J]. Plant Cell and Environment，2007，30（11）：1381-1399.
[9]付海辉，辛培尧，许玉兰，等. 几种经济植物UFGT基因的生物信息学分析[J]. 基因组学与应用生物学，2011，30（1）：92-102.刘星，胡金凤，王希东，等. 西瓜食酸菌CusB蛋白的生物信息学分析[J]. 江苏农业科学，2016，44（5）：34-37.
关键词：芒果；花色素苷；UFGT基因；基因克隆
中图分类号： S667.701；Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0031-03
芒果（Mangifera indica）是重要的热带、亚热带果树，其果实颜色多样[1]。芒果果实富含类胡萝卜素、花色素苷等物质，其中花色素苷合成途径是红色芒果果实着色的主要代谢途径。类黄酮糖基转移酶（UFGT）是花色素苷合成的最后一个酶，可以将不稳定的花色素催化成花色素苷。卢其能等[1]、刘海峰等[2]分别从红巴梨果皮、马铃薯以及山葡萄中克隆了UFGT 基因，并且作了表达分析，到目前为止，山竹子（Garcinia mangostana）、草莓（Fragaria×ananassa）、西洋梨（Pyrus communis）、葡萄柚（Citrus×paradisi）、荔枝（Litchi chinensis Sonn.）等果树中的UFGT基因得到了克隆[3-6]。UFGT是花色素苷合成的关键基因。Ju等发现，苹果果实发育过程中，UFGT只在果实接近成熟的转色期表达，表达的强度与花色素苷合成呈正相关[7]。Boss等对白皮葡萄、黑皮葡萄的不同组织进行表达分析发现，UFGT基因只在有色的葡萄果皮中表达[4]。本研究采用RACE方法从芒果的果实中克隆得到了一个UFGT基因，探讨该基因在芒果果实花色素苷合成的作用机制及其对果实着色的影响，深入揭示该基因在芒果果实花色素苷生物合成的分子机制，旨在为芒果果实着色提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
以贵妃芒果的果实（取自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所的农业部芒果种质资源圃）为试材。大肠杆菌DH5а为本实验室保存，引物合成自英骏生物技术有限公司，DEPC、IPTG、Tryptone、Yeast extract、Amp、X-GaL、pMD-19T载体、Taq DNA 聚合酶、dNTP、T4 DNA连接酶、各种限制性内切酶均购于大连宝生物公司。
1.2方法
参照王家保等所述的方法[5]提取芒果DNA，用无菌的双蒸水溶解，采用核酸蛋白测定仪进行测定，-20 ℃保存备用。采用天根总RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取芒果总RNA，用RNase-free无菌水溶解，用大连宝生物公司的DNase试剂盒进行DNA去除，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和DNA是否去除干净，并用核酸蛋白测定仪对所得RNA的D260 nm/D230 nm、D260 nm/D280 nm及浓度进行测定，用TaKaRa公司的3′和5′-RACE 试剂盒进行目的基因的3′、5′转录。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；95 ℃变性50 s，50 ℃复性50 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸7 min；反应体系为25 μL，其中含10×PCR buffer （含Mg2 ） 2.5 μL、25 ng/μL DNA模板2.0 μL、20 μmol引物各1.0 μL、2.5 U/μL Taq DNA聚合酶0.4 μL、5.0 mmol/L dNTPs 2.0 μL；反应体系在eppendor PCR仪上扩增，扩增反应结束后取10 μL进行扩增产物的电泳，采用gelred染色后在紫外凝胶成像仪上观察、拍照分析。
1.3UFGT基因全长cDNA和基因组DNA序列的获得
以贵妃芒果的果实总RNA作为模板，采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit （Clontech）反转录合成第一链cDNA，并参照该试剂盒的说明书进行cDNA 3′ 端和5′末端cDNA的扩增。根据cDNA片段的测序结果，分别设计2条上游引物，以接头为锚定引物进行半巢式PCR反应。将3′ 端和5′末端的PCR反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，确定所得到的片段大小是否与预测的片段大小一致。目的基因片段回收、连接、转化、鉴定及测序，并根据已知的片段和得到的cDNA 3′ 端和5′末端的序列结果拼接该基因的全长 cDNA。以上述cDNA和提取的基因组DNA为模板，设计特异引物，进行全长cDNA和基因组DNA序列扩增反应，PCR反应体系25 μL，从中取6 μL PCR产物加入0.2 mL PCR管中，加入1 μL 6×Loading Buffer，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增的片段大小是否正确。确定PCR产物中含有所需大小的目的片段一致后，对PCR产物进行普通琼脂糖凝胶电泳，用手术刀在紫外灯下切下含有目的片段胶块，再用DNA凝胶回收试剂盒（Agarose Gel DNA Purification Kit，TaKaRa公司）进行目的片段回收，参照试剂盒说明书上的步骤进行回收。取5 μL回收纯化后的目的DNA产物进行1.2%琼脂糖电泳检测，以检验回收效果及大致含量，根据回收产物片段大小及其有效浓度，取适量回收纯化的产物与克隆载体pMD19-T（TaKaRa公司）连接，目的DNA与克隆载体的摩尔比控制在3 ∶1左右。反应混合液包括1 μL pMD19-T vector、4 μL 纯化后的DNA、5 μL Ligation solution Ⅰ，混合均匀后在16 ℃ 下恒温水浴过夜连接。 1.4UFGT基因氨基酸序列的结构特征和分子进化的分析
将所扩增得到的全长序列进行NCBI序列比对，确定该基因是否为UFGT基因，并进行其他物种UFGT基因的比对，采用DNAMAN软件分析基因核苷酸和氨基酸的结构特征和同源性，分析该基因所推定氨基酸序列，进行多序列比较并构建系统树。
1.5表达分析
分别提取不同芒果品种的RNA，反转为cDNA 并采用Primer 5.0设计引物进行RT-PCR扩增。RT-PCR分析采用内参引物actin-F：5′-AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC-3′和actin-R：5′- TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA-3′。目的基因扩增采用引物UFGT-F：5′-CAGCATAGCCCATATAGCACTC-3′和UFGT-R：5′-CAATGGAGCCGATATAAAACTAT-3′，PCR 产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，采用Quantity One 软件进行数据分析，作出相对表达量。
2结果与分析
2.1UFGT基因的获得
根据得到的3′端、5′端序列信息进行拼接，最后得到UFGT基因的全长cDNA序列。设计特异引物进行全长cDNA和基因组DNA序列扩增，电泳结果如图1所示。将电泳条带回收测序后得到的UFGT基因的cDNA全长序列为1 573 bp，分析发现开放阅读框为 1 392 bp，编码463个氨基酸序列（图2）。通过NCBI上已经登录的苹果、草莓、荔枝的UFGT蛋白序列进行比对（图3），发现克隆的基因为UFGT基因。对基因组DNA扩增得到约2 770 bp的片段，通过与cDNA序列比对发现，该基因含有2个内含子，分别位于501～1 095 bp、1 548～2 330 bp之间（图4）。
2.2芒果UFGT基因的部分生物信息学分析
采用DNAMAN进行二级结构的预测，发现芒果UFGT基因蛋白的二级结果主要以无规则卷曲和β-折叠为主，也具有少量的α-螺旋结构（图5）。采用bioedit软件的Kyte 和Doolittle 算法对UFGT蛋白的亲水/疏水性（正值表示疏水性，负值表示亲水性）进行分析，UFGT蛋白所含的氨基酸主要介于 1.3～-3之间（图6），采用DNAMAN软件分析发现，芒果UFGT蛋白与荔枝、山竹子等热带果树的蛋白序列聚为一类。草莓、苹果、桃、西洋梨、樱桃等温带果树可以聚为一类（图7）。
2.3UFGT基因的RT-PCR分析
分别提取不同着色程度的芒果果皮RNA，反转录为 cDNA，通过上述RT-PCR分析的引物进行扩增，对扩增结果进行分析发现：该基因在红色果皮的贵妃的果实中表达较多，绿色果皮中次之，黄皮果皮中相对表达较少（图8），初步推断UFGT基因可能与红色果实的花色素苷合成有密切关系，而黄皮的芒果品种可能与类胡萝卜素合成有密切关系。
3结论与讨论
本研究成功从芒果果实中分离得到了1个全长UFGT基因，该基因的cDNA的开放阅读框为1 392 bp，编码463个氨基酸，对基因组分析发现，该基因含有2个内含子，荔枝的UFGT基因含有1个内含子。通过在线软件对cDNA和蛋白序列分析证实了该序列是植物UFGT基因的一员，也发现其所推导的氨基酸序列含有UDPGT、COG1819、MGT等保守结构域[8]。芒果UFGT基因与所选其他物种UFGT基因序列相比较发现，无论在全长cDNA序列上还是其编码氨基酸序列上都具有较高的保守结构域。同时，通过与其他部分物种的氨基酸序列构建系统发生树发现，芒果UFGT基因编码的蛋白与荔枝、山竹子等热带果树可以聚为一类，草莓、苹果、桃、西洋梨、樱桃等温带果树可以聚为一类。付海辉等采用MEGA 4.1软件对部分植物的UFGT基因分析发现，草莓、葡萄、苹果等可以聚为一类[9]，本研究的结果与其具有一致性。付海辉等预测，部分植物的UFGT基因可能亚细胞定位于液
泡或叶绿体中，在液泡中催化不稳定的花色素转化为稳定的花色素苷，从而使花色素苷在液泡中大量积累[9]。芒果UFGT基因是芒果花色素苷合成代谢途径中的关键基因，它对芒果果皮红色形成具有重要的作用。
参考文献：
[1]卢其能，杨清，沈春修. 马铃薯类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因的克隆与表达分析[J]. 华北农学报，2009，24（4）：11-16.
[2]刘海峰，杨成君，于淼，等. 山葡萄UDP-葡萄糖：类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因（3GT）cDNA的克隆和分析[J]. 植物生理学通讯，2009，45（8）：748-752.
[3]Palapol Y，Ketsa S，Kui L W，et al. A MYB transcription factor regulates anthocyanin biosynthesis in mangosteen （Garcinia mangostana L.） fruit during ripening[J]. Planta，2009，229（6）：1323-1334.
[4]Boss P K，Davies C，Robinson S P. Expression of anthocyanin biosyn
thesis pathway genes in red and white grapes[J]. Plant Molecular Biology，1996，32（3）：565-569.
[5]王家保，王令霞，刘志媛，等. 芒果DNA提取方法比较及ISSR反应体系的优化[J]. 生物技术，2005，15（5）：37-41.
[6]赵志常，胡福初，胡桂兵，等. 荔枝类黄酮糖基转移酶（UFGT）基因的克隆及其原核表达研究[J]. 广西师范大学学报：自然科学版，2011，29（4）：104-110.
[7]Ju Z G，Liu C L，Yuan Y B. Acitivties of chalcone synthase and UDPGal：flavonoid-3-O-glycosyltransferase in relation to anthocyanin synthesis in apple[J]. Scientia Horticulturae，1995，63：175-185.
[8]Castellarin S D，Pfeiffer A，Sivilotti P A，et al. Transcriptional regulation of anthocyanin biosynthesis in ripening fruits of grapevine under seasonal water deficit[J]. Plant Cell and Environment，2007，30（11）：1381-1399.
[9]付海辉，辛培尧，许玉兰，等. 几种经济植物UFGT基因的生物信息学分析[J]. 基因组学与应用生物学，2011，30（1）：92-102.刘星，胡金凤，王希东，等. 西瓜食酸菌CusB蛋白的生物信息学分析[J]. 江苏农业科学，2016，44（5）：34-37.