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(1.北京农学院植物科学技术学院，北京 102206；2.北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室，北京 102206)
摘要
［目的］探索过量表达miR319和过量表达LA对番茄果实品质的影响。［方法］以番茄野生型M82、过量表达miR319和过量表达LA番茄为材料，分析过量表达miR319和过量表达LA对番茄果实品质的影响。［结果］过量表达miR319植株的可滴定酸、可溶性糖、VC和番茄红素的含量下降，而过量表达LA植株的可滴定酸、可溶性糖、番茄红素的含量上升，VC含量下降。2个转基因植株可溶性蛋白的含量与M82比较都有所上升。［结论］过量表达miR319和过量表达LA对番茄果实品质的影响是相反的，过量表达LA可以提高番茄果实品质。
关键词 番茄（Solanumlycopersicum）；miR319；番茄品质
中图分类号 S188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06150-02
Effect of OverExpression miR319 on Fruit Quality of Tomato
CHANG Wei, YANG Rui et al
(College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206)
Abstract ［Objective］ The present study aimed to explore the effects of overexpression miR319 and overexpression LA on fruit quality of tomato. ［Method］ Effects of overexpression miR319 and overexpression LA on fruit quality of tomato were analyzed by using tomato wild type M82, overexpression miR319 and overexpression LA as material. ［Result］ The results showed that: The overexpression jawD titratable acid, soluble sugar content VC and Lycopene content were decreased, but overexpression LA, plant titratable, soluble sugar content and Lycopene content were increased, and VC content was decreased. And two transgenic plants soluble protein content were better than M82. ［Conclusion］ The effects of overexpression of miR319 and overexpression LA on fruit quality of tomato are opposite and overexpression LA can improve fruit quality .
Key words Tomato; MiR319; Tomato nutritional quality
基金项目 长城学者（CIT·&·TCD20130323）。
作者简介
昌伟（1989-），男，安徽滁州人，硕士研究生，研究方向：蔬菜生理与优质安全栽培。*通讯作者，实验师，从事蔬菜生理与优质安全研究。
收稿日期 20140531
番茄（Solanumlycopersicum）是蔬菜中营养价值较高的品种之一，也是近年来我国设施栽培面积较大的作物。番茄果实的发育是通过一系列生物和非生物因素相互调控的。茉莉酸作为植物调节剂，可以在番茄的整个生长过程起到非常重要的作用。魏佳等［1］发现利用茉莉酸突变体spr2发现茉莉酸能够促进果实发育时期还原糖的积累。张佳楠等［2］利用Micro-Tom为试验材料，外源喷施茉莉酸甲酯，发现番茄果实中果糖和葡萄糖含量在整个生长发育期都呈递增趋势。Schommer等［3］研究发现，miR319的靶基因TCP转录因子家族成员调控茉莉酸生物合成进程中关键酶基因LOX2从而控制着茉莉酸的生物合成。笔者以M82为背景的过量表达miR319和过量表达LA为材料，比较3个品种番茄果实的品质差异，探索miR319对番茄果实的影响，以期为番茄的进一步开发利用提供依据。
1材料与方法
1.1 材料
试验于2013年10月~3月在北京金六环农业园进行。试验材料为番茄野生种M82，以M82为背景的过量表达miR319和过量表达LA的转基因番茄。取新鲜果实，研磨成原浆，按照不同试验要求精确称量匀浆，然后进行各项品质指标的测定。
1.2 可溶性蛋白的测定
用考马斯亮蓝G-250法测定［4］。准确称取4.000 g番茄果实匀浆，加入10 ml蒸馏水混匀，于4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集上清液即为可溶性蛋白溶液。吸取1.0 ml上清液，加入5.0 ml考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2 min后在波长595 nm出比色。重复3次。
1.3 可溶性糖的测定
采用硫酸蒽酮比色法［4］，准确称取0.500 g番茄果实匀浆，加入到15 ml蒸馏水中，沸水煮沸20 min，冷却后定容至25 ml。离心10 min（5 000 r/min），上清液为待测液，在620 nm下测得吸光度。重复3次。
1.4 有机酸总量的测定
采用标准碱滴定定量法。取10.0 g匀浆，约用50 ml已煮沸、冷却的蒸馏水定容 250 ml。充分振荡后过滤。吸取20 ml滤液，加入酚酞，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液滴定。重复3次。
1.5 维生素C的测定
采用2,6-二氯酚靛酚法测定［4］。准确称取5.000 g番茄果实匀浆，加入10 ml浓度2%草酸，转移到50 ml容量瓶中定容。用高岭土和溶液混合，过滤。取10 ml滤液，用已标定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定。重复3次。
1.6 番茄红素的测定
用GB/T 14215-2008番茄酱罐头标准中测量番茄红素的方法测量［5］。准确称取0.200 g番茄果实匀浆，置于10 ml烧杯中，加入少量无水甲醇，过滤，反复至无色，保留残渣。分次用少量甲苯浸提番茄红素，过滤，至滤液无色，滤液定容至50 ml。在485 nm下测定提取液的吸光度。重复3次。
1.7 统计分析
数据应用Excel2007、spss19.0和origin8分别进行数据统计、差异显著性分析和作图分析。
2 结果与分析
2.1 转基因植株对番茄果实可溶性糖的影响
图1表明，M82、过量表达miR319植株、过量表达LA植株的含糖量分别是5.69%、4.52%和7.49%。过量表达miR319之后番茄果实的含糖量下降，而过量表达miR319靶基因LA之后，番茄果实的含糖量上升。这可能是在番茄果实成熟时，糖含量受到miR319的调控，从而使番茄果实的含糖量下降。结果表明，在番茄果实成熟时，过量表达miR319植株的番茄果实含糖量下降，而过量表达LA植株的番茄果实含糖量上升。miR319可能单独或者联合其他机制调控果实糖积累时的过程，是果实内的糖含量发生变化。
注：不同大写字母表示差异极显著，不同小写字母表示差异显著，相同字母表示差异不显著，下同。
图1 不同番茄果实含糖量
2.2 转基因植株对番茄果实可滴定酸的影响
图2表明，M82果实的可滴定酸含量为0.61%，过量表达miR319植株的果实可滴定酸含量为0.48%，下降0.13%，下降达到极显著（P<0.01）。过量表达LA果实的可滴定酸含量增加0.1%，增加达到极显著（P<0.01）。这可能在番茄果实成熟的过程中，可滴定酸含量受到miR319的负调控，从而使番茄果实内的可滴定酸含量下降；而过量表达miR319靶基因LA时，抑制了miR319的表达，使番茄果实内的可滴定酸含量上升。
图2 不同番茄果实可滴定酸含量
2.3 转基因植株对番茄果实可溶性蛋白的影响
图3表明，M82、过量表达miR319植株、过量表达LA植株的蛋白质含量为分别是122.1、138.5和134.4 μg/g。过量表达miR319和过量表达LA植株番茄果实的可溶性蛋白相对于M82来说分别上升16.4和13.3 μg/g，上升都达到了显著性（P<0.05）。有可能是在番茄果实成熟的过程中，过量表达miR319和过量表达LA植株体内的诱导番茄果实中其他蛋白质的表达，使果实内的可溶性蛋白含量上升。
图3 不同番茄可溶性蛋白含量
2.4 转基因植株对番茄果实维生素C的影响
图4表明，M82、过量表达miR319和过量表达LA的维生素C的含量分别是1 762.7、1 440.7和1 593.2 mg/kg。结果表明，在番茄果实成熟时，过量表达miR319植株的番茄果实和过量表达LA植株的番茄果实的维生素C含量都有所下降。与野生番茄M82相比较都有极显著差异（P<0.01）。在番茄果实成熟的时候，过表达miR319和过表达LA的维生素C含量下降。
图4 不同番茄维生素C含量
2.5 转基因植株对番茄果实番茄红素的影响
图5表明，M82、过量表达miR319和过量表达LA的番茄红素含量分别为89.0、84.0和98.0 mg/kg FW。与M82相比，过量表达miR319植株的番茄果实番茄红素下降5.0 mg/kg FW，而过量表达LA植株的番茄果实番茄红素上升9.0 mg/kg FW，效果显著（P<0.05）。汪俏梅等［6］研究发现，内源茉莉酸能通过邮箱番茄红素合成相关基因而正调控番茄红素的合成，MeJA处理可以提高番茄红素的合成。试验结果表明，在过量表达miR319植株中，miR319负调控茉莉酸合成通路中Lox2基因，使番茄内的茉莉酸含量下降，从而使果实内的番茄红素下降。而在过量表达LA植株中，正向调控茉莉酸表达，使番茄中茉莉酸含量上升，使番茄果实内的番茄红素含量上升。
图5 不同番茄红素含量
3结论与讨论
番茄作为模式植物，在番茄的转基因上科学家们做了大量的试验，主要包括一些抗病虫害、提高产量、延迟成熟等品种。1994年，Calgene公司第1次将多聚半乳糖醛酸酶的反
义cDNA转入番茄的基因组中，首先研制出了延迟成熟的转基因番茄Flavr-SavrTMP中，并被批准用于商业化种植，这给研制转基因番茄提供了可行性。但是现在转基因食品在国内没有得到大范围的推广。试验结果发现，在过量表达miR319植株番茄果实中可溶性糖和可溶性蛋白都有所下降，说明在番茄果实成熟期，过量表达miR319植株体内中miR319表达量的提高，导致植株体内茉莉酸含量下降，使可溶性糖和可溶性蛋白的含量下降，而在过量表达miR319靶基因LA植株中，使茉莉酸含量上升，可溶性糖和可溶性蛋白的含量上升，这与前人的研究一致［1］。激素对植物体的整个生长发育的调节机制是非常复杂的，通常果实发育并不是由单一激素来调控的，大多是多个激素共同调控的结果。所以下一步的工作可以通过对多个激素共同的作用来研究对番茄果实的影响。
利用转基因植株来研究果实的生长机制和提高番茄产量是农业科学非常重要的手段。从试验结果到生产实践是需要非常长的时间和机制。试验仅仅是从果实品质来评价转基因番茄，如果后期要大面积推广，应该严格按照国家关于转基因作物的相关标准进行评价，并且在种植过程中为防止转基因番茄破坏生态平衡，应该在相对封闭的环境中种植和管理，要严格与传统的农作物分开，规范转基因番茄的生产和加工过程。
参考文献
［1］ 魏佳，贾承国，李振，等.利用突变体研究植物激素对番茄果实品质的影响［J］.核农学报，2009，23(3):521-525.
［2］ 张佳楠,崔娜,王楠,等.外源茉莉酸甲酯对不同发育时期番茄果实糖含量的影响［C］//中国园艺学会.中国园艺学会2013年学术年会论文摘要集.中国园艺学会,2013:1.
［3］ SCHOMMER C，PALATNIK J F，AGGARWAL P，et al.Control of jasmonate biosynthesis and senescence by miR319 targets［J］.PLoS Biology，2008，6(9):230.
［4］ 曹建康，姜微波，赵玉梅.果树采后生理生化实验指导［M］.北京：中国轻工业出版社，2007.
［5］ 尚德军，王军.番茄红素测量方法的改进［J］.现代科学仪器，2006（1）:117-118.
［6］ 汪俏梅，张敏，陈德龙.果实中类胡萝卜素的激素调控［J/OL］.http://www.docin.com/p-561020321.html.
摘要
［目的］探索过量表达miR319和过量表达LA对番茄果实品质的影响。［方法］以番茄野生型M82、过量表达miR319和过量表达LA番茄为材料，分析过量表达miR319和过量表达LA对番茄果实品质的影响。［结果］过量表达miR319植株的可滴定酸、可溶性糖、VC和番茄红素的含量下降，而过量表达LA植株的可滴定酸、可溶性糖、番茄红素的含量上升，VC含量下降。2个转基因植株可溶性蛋白的含量与M82比较都有所上升。［结论］过量表达miR319和过量表达LA对番茄果实品质的影响是相反的，过量表达LA可以提高番茄果实品质。
关键词 番茄（Solanumlycopersicum）；miR319；番茄品质
中图分类号 S188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06150-02
Effect of OverExpression miR319 on Fruit Quality of Tomato
CHANG Wei, YANG Rui et al
(College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206)
Abstract ［Objective］ The present study aimed to explore the effects of overexpression miR319 and overexpression LA on fruit quality of tomato. ［Method］ Effects of overexpression miR319 and overexpression LA on fruit quality of tomato were analyzed by using tomato wild type M82, overexpression miR319 and overexpression LA as material. ［Result］ The results showed that: The overexpression jawD titratable acid, soluble sugar content VC and Lycopene content were decreased, but overexpression LA, plant titratable, soluble sugar content and Lycopene content were increased, and VC content was decreased. And two transgenic plants soluble protein content were better than M82. ［Conclusion］ The effects of overexpression of miR319 and overexpression LA on fruit quality of tomato are opposite and overexpression LA can improve fruit quality .
Key words Tomato; MiR319; Tomato nutritional quality
基金项目 长城学者（CIT·&·TCD20130323）。
作者简介
昌伟（1989-），男，安徽滁州人，硕士研究生，研究方向：蔬菜生理与优质安全栽培。*通讯作者，实验师，从事蔬菜生理与优质安全研究。
收稿日期 20140531
番茄（Solanumlycopersicum）是蔬菜中营养价值较高的品种之一，也是近年来我国设施栽培面积较大的作物。番茄果实的发育是通过一系列生物和非生物因素相互调控的。茉莉酸作为植物调节剂，可以在番茄的整个生长过程起到非常重要的作用。魏佳等［1］发现利用茉莉酸突变体spr2发现茉莉酸能够促进果实发育时期还原糖的积累。张佳楠等［2］利用Micro-Tom为试验材料，外源喷施茉莉酸甲酯，发现番茄果实中果糖和葡萄糖含量在整个生长发育期都呈递增趋势。Schommer等［3］研究发现，miR319的靶基因TCP转录因子家族成员调控茉莉酸生物合成进程中关键酶基因LOX2从而控制着茉莉酸的生物合成。笔者以M82为背景的过量表达miR319和过量表达LA为材料，比较3个品种番茄果实的品质差异，探索miR319对番茄果实的影响，以期为番茄的进一步开发利用提供依据。
1材料与方法
1.1 材料
试验于2013年10月~3月在北京金六环农业园进行。试验材料为番茄野生种M82，以M82为背景的过量表达miR319和过量表达LA的转基因番茄。取新鲜果实，研磨成原浆，按照不同试验要求精确称量匀浆，然后进行各项品质指标的测定。
1.2 可溶性蛋白的测定
用考马斯亮蓝G-250法测定［4］。准确称取4.000 g番茄果实匀浆，加入10 ml蒸馏水混匀，于4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集上清液即为可溶性蛋白溶液。吸取1.0 ml上清液，加入5.0 ml考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2 min后在波长595 nm出比色。重复3次。
1.3 可溶性糖的测定
采用硫酸蒽酮比色法［4］，准确称取0.500 g番茄果实匀浆，加入到15 ml蒸馏水中，沸水煮沸20 min，冷却后定容至25 ml。离心10 min（5 000 r/min），上清液为待测液，在620 nm下测得吸光度。重复3次。
1.4 有机酸总量的测定
采用标准碱滴定定量法。取10.0 g匀浆，约用50 ml已煮沸、冷却的蒸馏水定容 250 ml。充分振荡后过滤。吸取20 ml滤液，加入酚酞，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液滴定。重复3次。
1.5 维生素C的测定
采用2,6-二氯酚靛酚法测定［4］。准确称取5.000 g番茄果实匀浆，加入10 ml浓度2%草酸，转移到50 ml容量瓶中定容。用高岭土和溶液混合，过滤。取10 ml滤液，用已标定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定。重复3次。
1.6 番茄红素的测定
用GB/T 14215-2008番茄酱罐头标准中测量番茄红素的方法测量［5］。准确称取0.200 g番茄果实匀浆，置于10 ml烧杯中，加入少量无水甲醇，过滤，反复至无色，保留残渣。分次用少量甲苯浸提番茄红素，过滤，至滤液无色，滤液定容至50 ml。在485 nm下测定提取液的吸光度。重复3次。
1.7 统计分析
数据应用Excel2007、spss19.0和origin8分别进行数据统计、差异显著性分析和作图分析。
2 结果与分析
2.1 转基因植株对番茄果实可溶性糖的影响
图1表明，M82、过量表达miR319植株、过量表达LA植株的含糖量分别是5.69%、4.52%和7.49%。过量表达miR319之后番茄果实的含糖量下降，而过量表达miR319靶基因LA之后，番茄果实的含糖量上升。这可能是在番茄果实成熟时，糖含量受到miR319的调控，从而使番茄果实的含糖量下降。结果表明，在番茄果实成熟时，过量表达miR319植株的番茄果实含糖量下降，而过量表达LA植株的番茄果实含糖量上升。miR319可能单独或者联合其他机制调控果实糖积累时的过程，是果实内的糖含量发生变化。
注：不同大写字母表示差异极显著，不同小写字母表示差异显著，相同字母表示差异不显著，下同。
图1 不同番茄果实含糖量
2.2 转基因植株对番茄果实可滴定酸的影响
图2表明，M82果实的可滴定酸含量为0.61%，过量表达miR319植株的果实可滴定酸含量为0.48%，下降0.13%，下降达到极显著（P<0.01）。过量表达LA果实的可滴定酸含量增加0.1%，增加达到极显著（P<0.01）。这可能在番茄果实成熟的过程中，可滴定酸含量受到miR319的负调控，从而使番茄果实内的可滴定酸含量下降；而过量表达miR319靶基因LA时，抑制了miR319的表达，使番茄果实内的可滴定酸含量上升。
图2 不同番茄果实可滴定酸含量
2.3 转基因植株对番茄果实可溶性蛋白的影响
图3表明，M82、过量表达miR319植株、过量表达LA植株的蛋白质含量为分别是122.1、138.5和134.4 μg/g。过量表达miR319和过量表达LA植株番茄果实的可溶性蛋白相对于M82来说分别上升16.4和13.3 μg/g，上升都达到了显著性（P<0.05）。有可能是在番茄果实成熟的过程中，过量表达miR319和过量表达LA植株体内的诱导番茄果实中其他蛋白质的表达，使果实内的可溶性蛋白含量上升。
图3 不同番茄可溶性蛋白含量
2.4 转基因植株对番茄果实维生素C的影响
图4表明，M82、过量表达miR319和过量表达LA的维生素C的含量分别是1 762.7、1 440.7和1 593.2 mg/kg。结果表明，在番茄果实成熟时，过量表达miR319植株的番茄果实和过量表达LA植株的番茄果实的维生素C含量都有所下降。与野生番茄M82相比较都有极显著差异（P<0.01）。在番茄果实成熟的时候，过表达miR319和过表达LA的维生素C含量下降。
图4 不同番茄维生素C含量
2.5 转基因植株对番茄果实番茄红素的影响
图5表明，M82、过量表达miR319和过量表达LA的番茄红素含量分别为89.0、84.0和98.0 mg/kg FW。与M82相比，过量表达miR319植株的番茄果实番茄红素下降5.0 mg/kg FW，而过量表达LA植株的番茄果实番茄红素上升9.0 mg/kg FW，效果显著（P<0.05）。汪俏梅等［6］研究发现，内源茉莉酸能通过邮箱番茄红素合成相关基因而正调控番茄红素的合成，MeJA处理可以提高番茄红素的合成。试验结果表明，在过量表达miR319植株中，miR319负调控茉莉酸合成通路中Lox2基因，使番茄内的茉莉酸含量下降，从而使果实内的番茄红素下降。而在过量表达LA植株中，正向调控茉莉酸表达，使番茄中茉莉酸含量上升，使番茄果实内的番茄红素含量上升。
图5 不同番茄红素含量
3结论与讨论
番茄作为模式植物，在番茄的转基因上科学家们做了大量的试验，主要包括一些抗病虫害、提高产量、延迟成熟等品种。1994年，Calgene公司第1次将多聚半乳糖醛酸酶的反
义cDNA转入番茄的基因组中，首先研制出了延迟成熟的转基因番茄Flavr-SavrTMP中，并被批准用于商业化种植，这给研制转基因番茄提供了可行性。但是现在转基因食品在国内没有得到大范围的推广。试验结果发现，在过量表达miR319植株番茄果实中可溶性糖和可溶性蛋白都有所下降，说明在番茄果实成熟期，过量表达miR319植株体内中miR319表达量的提高，导致植株体内茉莉酸含量下降，使可溶性糖和可溶性蛋白的含量下降，而在过量表达miR319靶基因LA植株中，使茉莉酸含量上升，可溶性糖和可溶性蛋白的含量上升，这与前人的研究一致［1］。激素对植物体的整个生长发育的调节机制是非常复杂的，通常果实发育并不是由单一激素来调控的，大多是多个激素共同调控的结果。所以下一步的工作可以通过对多个激素共同的作用来研究对番茄果实的影响。
利用转基因植株来研究果实的生长机制和提高番茄产量是农业科学非常重要的手段。从试验结果到生产实践是需要非常长的时间和机制。试验仅仅是从果实品质来评价转基因番茄，如果后期要大面积推广，应该严格按照国家关于转基因作物的相关标准进行评价，并且在种植过程中为防止转基因番茄破坏生态平衡，应该在相对封闭的环境中种植和管理，要严格与传统的农作物分开，规范转基因番茄的生产和加工过程。
参考文献
［1］ 魏佳，贾承国，李振，等.利用突变体研究植物激素对番茄果实品质的影响［J］.核农学报，2009，23(3):521-525.
［2］ 张佳楠,崔娜,王楠,等.外源茉莉酸甲酯对不同发育时期番茄果实糖含量的影响［C］//中国园艺学会.中国园艺学会2013年学术年会论文摘要集.中国园艺学会,2013:1.
［3］ SCHOMMER C，PALATNIK J F，AGGARWAL P，et al.Control of jasmonate biosynthesis and senescence by miR319 targets［J］.PLoS Biology，2008，6(9):230.
［4］ 曹建康，姜微波，赵玉梅.果树采后生理生化实验指导［M］.北京：中国轻工业出版社，2007.
［5］ 尚德军，王军.番茄红素测量方法的改进［J］.现代科学仪器，2006（1）:117-118.
［6］ 汪俏梅，张敏，陈德龙.果实中类胡萝卜素的激素调控［J/OL］.http://www.docin.com/p-561020321.html.