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摘 要 实验室引入新标准方法开展兽药残留检测时，应在实验室内对标准方法进行验证。因此，根据农业部2386号公告、NY/T 1896-2010、GB/T 27417-2017、GB/T 35655-2017介绍了如何对兽药残留色谱定量分析方法进行验证，以期为县级农产品质量安全检测实验室开展兽药残留检测工作提供参考。
关键词 兽药残留检测;标准方法;方法验证;色谱定量分析
中图分类号：S859.84 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.18.089
方法验证是实验室建立可靠分析系统的基础，是实验室证明其具备技术能力运用新标准进行检测，是实验室证明其所得检测结果准确性、可靠性的一种手段。实验室在初次使用标准方法前、在标准方法发生变化时，应对标准方法进行验证，并提供相关证明材料。因此，基于农业部2386号公告和NY/T 1896-2010中方法验证的要求，在进行方法验证时应对方法性能指标选择性、检出限、定量限、线性范围、正确度、精密度和稳健性进行验证。
1 方法性能参数的验证及其质量控制要求
1.1 选择性
标准方法已经采取了必要的手段排除了重大干扰物质对分析方法的影响，但对于应用方法的实验室验证，应依据检测方法的程序检查因试剂耗材、器皿、基质等因素所导致的干扰情况。
1）试剂空白。对试验中所用到的试剂，按照检测方法的要求进行测试，观察色谱图中的出峰，以检查在整个试验过程中所用的试剂、器皿及其他试验用品是否对目标组分的分析存在干扰;
2）使用有证标准物质配制一定浓度的单一目标组分标准工作溶液和多目标组分的混合标准工作溶液，上机确定各目标组分保留时间、分离度、峰形及峰面积。该测试数据及图谱可以为目标组分的识别和含量计算、考察配制的标准溶液有效期提供初始比对依据;
3）根据类别分析不同基质的空白样品，检查在目标物出现的区域是否存在干扰;
4）在有代表性空白样品中添加一定浓度目标组分进行检测，检查目标组分在图谱中的出峰区域是否有干扰。
1.2 检出限
对于有允许限量规定的目标分析物，独立检测检出限浓度水平下制备的10个标准添加样品，目标组分检出概率应达到50%;对于规定为不得检出的目标分析物，在此浓度水平下独立检测20个加标样品，检出概率应达到95%。
1.3 定量限
在标准所限定的检测范围，制备定量限浓度水平下的标准添加样品，依据检测方法进行试验，依据农业部2386号公告或NY/T 1896-2010对检测结果的正确度和精密度进行评价，以此判断实验室检测能力能否达到方法的定量限。
1）使用空白样品制备7个定量限浓度水平下标准添加样品;
2）检测上述样品，得到相应的响应信号（如峰面积、峰高等），并计算出样品前处理后目标组分的浓度（或量），根据添加量计算出该浓度水平的添加回收率及平行样品间的相对标准偏差;
3）得到的回收率和相对标准偏差应满足规范中相应的浓度水平下的回收率和相对标准偏差要求。
1.4 线性范围
校准曲线（一般为线性曲线）至少做5个浓度点（不包含空白浓度点），浓度范围尽可能覆盖2个数量级，每个浓度点重复配制2～3个，定量限、最大残留限量或10倍定量限及被测样品中目标组分浓度应在校准曲线的范围内，曲线相关系数不低于0.997。列出校准曲线的回归方程、相关系数，并附上机检测的色谱图。
1.5 正确度
一般采用测定添加回收率的方法对农、兽药药物残留的正确度进行评价。添加回收试验一般做3个浓度水平，每个水平重复检测不少于3次，并计算同一水平下检测结果平均值及添加回收率[1]。
1）对于禁用药物，在方法定量限、2倍方法定量限和10倍方法定量限进行3水平添加回收试验;
2）对于已制定最大残留限量的药物，在1/2最大残留限量、最大残留限量、2倍最大残留限量3个水平点进行试验，如果最大残留限量值是定量限，可参考禁用药物进行试验;
3）对于未制定最大残留限量的，可在方法定量限、常见限量指标和某一适当点进行3水平试验。
1.6 精密度
在重复性的测试中自由度至少应为6。即对一个样品至少平行测定7次;对2个样品每个样品至少平行测定4次;对3个样品每个样品至少平行测定3次。
重复性的试验可采用在空白样品中添加一定浓度的目标分析物，然后在较短的时间内由同一个检测人员进行测定，并计算结果的平均值、标准偏差和相对标准偏差（即变异系数）。
1.7 稳健度
稳健度主要是指可通过由实验室人员预先设计好的微小的合理变化因素，并综合分析它们的直接影响。对稳健度考察的分析方法来源于《化学分析实验室协同试验设计及统计分析手册》，采用7因素2水平的正交试验对稳健度进行驗证[2]。
1）查找在样品预处理、提取、净化、分析等过程中可能影响检测结果的因素。可以包括不同来源试剂耗材、不同样品、不同温度、不同pH值及其他可能出现的因素。对变量进行考察时，同一因素不同水平的值推荐为方法规定值的±10%，如称样量为5.00 g，其稳健度考察水平为4.50 g和5.50 g;消解时硝酸的加入量为10 mL，其稳健度考察水平为9 mL和11 mL[3]。
2）实验室应仔细分析影响因素，从中选择7个重要因素作为考察对象。如果所要考察的因素数量多于7个，可设计多个试验方案;相反考察的因素不到7个，例如只考察6个因素，则最后一个因素可以设为常量而不需要进行考察，但列为常量的因素也应纳入计算和统计。7因素2水平正交试验表见表1。 3）将各大写的因素和小写的因素分为2组，由此计算各个因素变化对结果的影响量。如因素从G到g变化的影响量可由编号1、4、6、7号试验结果的平均值和编号2、3、5、8试验结果的平均值之间的差值得出。当2组计算公式相减求G到g因素变化对结果影响量时，大写因素A到F和小写因素a到f均在2组平均值公式中出现了2次，2平均值相减后，A/a到F/f因素变化对结果的影响均被抵消，按此方式可求得A/a到G/g到各因素变化对结果的影响量[4]。
d1=A-a=（I+II+III+IV）/4-（V+VI+VII+VIII）/4
d2=B-b=（I+II+V+VI）/4-（III+IV+VII+VIII）/4
d3=C-c=（I+II+VII+VIII）/4-（III+IV+V+VI）/4
d4=D-d=（I+III+V+VII）/4-（II+IV+VI+VIII）/4
d5=E-e=（I+III+VI+VIII）/4-（II+IV+V+VII）/4
d6=F-f=（I+IV+V+VIII）/4-（II+III+VI+VII）/4
d7=G-g=（I+IV+VI+VII）/4-（II+III+V+VIII）/4
4）计算该稳健性试验条件下8次测定结果的标准偏差，将其与上述7个影响量进行比较，如果影响量大于2倍标准偏差，则该因素的影响是显著的。在总结验证结果时，应特别指出，并要求检测人员小心地控制，必要时编制作业指导书。
2 结语
实验室基于对影响因素的有效控制为前提，以节约人力、物力、财力、提高工作效率和易于操作为原则对方法性能指标进行验证。笔者只对方法性能指标的验证方式进行了论述，实验室还应依据相关标准、规范要求对人员、仪器设备、环境等因素进行考察，以证明实验室具备相应的能力运用该方法[5]。
1）选择性。色谱检测结果的定性是基于目标物的保留值，但仅根据保留值对一个完全未知的样品定性是不可靠的。在人员、试剂耗材、标准物质、仪器设备和环境条件一定的条件下，在分析中应尽量选择不同种类有代表性的样品进行验证，以确定样品基质对检测结果的干扰情况。为确保检测结果的准确，出现阳性结果时，实验室应对检测结果进行复检[6]。
2）检出限和定量限。在实际检测工作中，检测结果在方法检出限以下时，报告为“未检出”，并标注出目标物的方法检出限;检测结果在方法定量限以上时，报告检测结果;检测结果在检出限以上，定量限以下时，检测结果报告为“定性检出”[7]。
3）线性范围。由于色谱检测器稳定性的问题，其响应值随时间在变化，在实验检测工作中如采用标准曲线校正，每条曲线使用的时间往往比较短，反复校正曲线工作量比较大;在实际检测工作中通常使用单点粗筛，对阳性或超标样品，配相近的浓度点标准溶液或基质标液进行校正[8]。
4）正确度和精密度。精密度的验证可与正确度的验证同步进行，试验的浓度水平依据正确度的验证要求进行选取，试验的结果应达到相关标准和规范的要求。
5）稳健性。建议采用关注浓度水平下的标准添加样品作为稳健性考察的样品。如果将称样量作为一个考察因素，加标时应确保每一份试样中加入的目标分析物的质量分数是一致的，以免人为的放大称样量对结果的影响。
参考文献：
[1] 国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.合格评定 化学分析方法确认和验证指南：GB/T 27417—2017[S].北京：中國标准出版社，2017.
[2] 国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.化学分析方法验证确认和内部质量控制实施指南 色谱分析：GB/T 35655—2017[S].北京：中国标准出版社，2018.
[3] 国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.实验室质量控制规范，食品理化检测：GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.
[4] 国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.化学分析方法验证确认和内部质量控制要求：GB/T 32465—2015[S].北京：中国标准出版社，2016.
[5] 农业部.农药残留检测方法国家标准编制指南（中华人民共和国农业部2386号公告）[EB/OL].（2016-04-11）[2021-05-20].http：//law.foodmate.net/show-188438.html.
[6] 农业部.兽药残留实验室质量控制规范：NY/T 1896-2010[S].北京：中国农业出版社，2010.
[7] 国家质量监督检验检疫总局.出口食品、化妆品理化测定方法标准编写的基本规定：SN/T 0001-2016[S].北京：中国标准出版社，2017.
[8] 郑卫东.化学分析实验室协同试验设计及统计分析手册[M].成都：四川科学技术出版社，2014：44-47.
（责任编辑：刘宁宁）
关键词 兽药残留检测;标准方法;方法验证;色谱定量分析
中图分类号：S859.84 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.18.089
方法验证是实验室建立可靠分析系统的基础，是实验室证明其具备技术能力运用新标准进行检测，是实验室证明其所得检测结果准确性、可靠性的一种手段。实验室在初次使用标准方法前、在标准方法发生变化时，应对标准方法进行验证，并提供相关证明材料。因此，基于农业部2386号公告和NY/T 1896-2010中方法验证的要求，在进行方法验证时应对方法性能指标选择性、检出限、定量限、线性范围、正确度、精密度和稳健性进行验证。
1 方法性能参数的验证及其质量控制要求
1.1 选择性
标准方法已经采取了必要的手段排除了重大干扰物质对分析方法的影响，但对于应用方法的实验室验证，应依据检测方法的程序检查因试剂耗材、器皿、基质等因素所导致的干扰情况。
1）试剂空白。对试验中所用到的试剂，按照检测方法的要求进行测试，观察色谱图中的出峰，以检查在整个试验过程中所用的试剂、器皿及其他试验用品是否对目标组分的分析存在干扰;
2）使用有证标准物质配制一定浓度的单一目标组分标准工作溶液和多目标组分的混合标准工作溶液，上机确定各目标组分保留时间、分离度、峰形及峰面积。该测试数据及图谱可以为目标组分的识别和含量计算、考察配制的标准溶液有效期提供初始比对依据;
3）根据类别分析不同基质的空白样品，检查在目标物出现的区域是否存在干扰;
4）在有代表性空白样品中添加一定浓度目标组分进行检测，检查目标组分在图谱中的出峰区域是否有干扰。
1.2 检出限
对于有允许限量规定的目标分析物，独立检测检出限浓度水平下制备的10个标准添加样品，目标组分检出概率应达到50%;对于规定为不得检出的目标分析物，在此浓度水平下独立检测20个加标样品，检出概率应达到95%。
1.3 定量限
在标准所限定的检测范围，制备定量限浓度水平下的标准添加样品，依据检测方法进行试验，依据农业部2386号公告或NY/T 1896-2010对检测结果的正确度和精密度进行评价，以此判断实验室检测能力能否达到方法的定量限。
1）使用空白样品制备7个定量限浓度水平下标准添加样品;
2）检测上述样品，得到相应的响应信号（如峰面积、峰高等），并计算出样品前处理后目标组分的浓度（或量），根据添加量计算出该浓度水平的添加回收率及平行样品间的相对标准偏差;
3）得到的回收率和相对标准偏差应满足规范中相应的浓度水平下的回收率和相对标准偏差要求。
1.4 线性范围
校准曲线（一般为线性曲线）至少做5个浓度点（不包含空白浓度点），浓度范围尽可能覆盖2个数量级，每个浓度点重复配制2～3个，定量限、最大残留限量或10倍定量限及被测样品中目标组分浓度应在校准曲线的范围内，曲线相关系数不低于0.997。列出校准曲线的回归方程、相关系数，并附上机检测的色谱图。
1.5 正确度
一般采用测定添加回收率的方法对农、兽药药物残留的正确度进行评价。添加回收试验一般做3个浓度水平，每个水平重复检测不少于3次，并计算同一水平下检测结果平均值及添加回收率[1]。
1）对于禁用药物，在方法定量限、2倍方法定量限和10倍方法定量限进行3水平添加回收试验;
2）对于已制定最大残留限量的药物，在1/2最大残留限量、最大残留限量、2倍最大残留限量3个水平点进行试验，如果最大残留限量值是定量限，可参考禁用药物进行试验;
3）对于未制定最大残留限量的，可在方法定量限、常见限量指标和某一适当点进行3水平试验。
1.6 精密度
在重复性的测试中自由度至少应为6。即对一个样品至少平行测定7次;对2个样品每个样品至少平行测定4次;对3个样品每个样品至少平行测定3次。
重复性的试验可采用在空白样品中添加一定浓度的目标分析物，然后在较短的时间内由同一个检测人员进行测定，并计算结果的平均值、标准偏差和相对标准偏差（即变异系数）。
1.7 稳健度
稳健度主要是指可通过由实验室人员预先设计好的微小的合理变化因素，并综合分析它们的直接影响。对稳健度考察的分析方法来源于《化学分析实验室协同试验设计及统计分析手册》，采用7因素2水平的正交试验对稳健度进行驗证[2]。
1）查找在样品预处理、提取、净化、分析等过程中可能影响检测结果的因素。可以包括不同来源试剂耗材、不同样品、不同温度、不同pH值及其他可能出现的因素。对变量进行考察时，同一因素不同水平的值推荐为方法规定值的±10%，如称样量为5.00 g，其稳健度考察水平为4.50 g和5.50 g;消解时硝酸的加入量为10 mL，其稳健度考察水平为9 mL和11 mL[3]。
2）实验室应仔细分析影响因素，从中选择7个重要因素作为考察对象。如果所要考察的因素数量多于7个，可设计多个试验方案;相反考察的因素不到7个，例如只考察6个因素，则最后一个因素可以设为常量而不需要进行考察，但列为常量的因素也应纳入计算和统计。7因素2水平正交试验表见表1。 3）将各大写的因素和小写的因素分为2组，由此计算各个因素变化对结果的影响量。如因素从G到g变化的影响量可由编号1、4、6、7号试验结果的平均值和编号2、3、5、8试验结果的平均值之间的差值得出。当2组计算公式相减求G到g因素变化对结果影响量时，大写因素A到F和小写因素a到f均在2组平均值公式中出现了2次，2平均值相减后，A/a到F/f因素变化对结果的影响均被抵消，按此方式可求得A/a到G/g到各因素变化对结果的影响量[4]。
d1=A-a=（I+II+III+IV）/4-（V+VI+VII+VIII）/4
d2=B-b=（I+II+V+VI）/4-（III+IV+VII+VIII）/4
d3=C-c=（I+II+VII+VIII）/4-（III+IV+V+VI）/4
d4=D-d=（I+III+V+VII）/4-（II+IV+VI+VIII）/4
d5=E-e=（I+III+VI+VIII）/4-（II+IV+V+VII）/4
d6=F-f=（I+IV+V+VIII）/4-（II+III+VI+VII）/4
d7=G-g=（I+IV+VI+VII）/4-（II+III+V+VIII）/4
4）计算该稳健性试验条件下8次测定结果的标准偏差，将其与上述7个影响量进行比较，如果影响量大于2倍标准偏差，则该因素的影响是显著的。在总结验证结果时，应特别指出，并要求检测人员小心地控制，必要时编制作业指导书。
2 结语
实验室基于对影响因素的有效控制为前提，以节约人力、物力、财力、提高工作效率和易于操作为原则对方法性能指标进行验证。笔者只对方法性能指标的验证方式进行了论述，实验室还应依据相关标准、规范要求对人员、仪器设备、环境等因素进行考察，以证明实验室具备相应的能力运用该方法[5]。
1）选择性。色谱检测结果的定性是基于目标物的保留值，但仅根据保留值对一个完全未知的样品定性是不可靠的。在人员、试剂耗材、标准物质、仪器设备和环境条件一定的条件下，在分析中应尽量选择不同种类有代表性的样品进行验证，以确定样品基质对检测结果的干扰情况。为确保检测结果的准确，出现阳性结果时，实验室应对检测结果进行复检[6]。
2）检出限和定量限。在实际检测工作中，检测结果在方法检出限以下时，报告为“未检出”，并标注出目标物的方法检出限;检测结果在方法定量限以上时，报告检测结果;检测结果在检出限以上，定量限以下时，检测结果报告为“定性检出”[7]。
3）线性范围。由于色谱检测器稳定性的问题，其响应值随时间在变化，在实验检测工作中如采用标准曲线校正，每条曲线使用的时间往往比较短，反复校正曲线工作量比较大;在实际检测工作中通常使用单点粗筛，对阳性或超标样品，配相近的浓度点标准溶液或基质标液进行校正[8]。
4）正确度和精密度。精密度的验证可与正确度的验证同步进行，试验的浓度水平依据正确度的验证要求进行选取，试验的结果应达到相关标准和规范的要求。
5）稳健性。建议采用关注浓度水平下的标准添加样品作为稳健性考察的样品。如果将称样量作为一个考察因素，加标时应确保每一份试样中加入的目标分析物的质量分数是一致的，以免人为的放大称样量对结果的影响。
参考文献：
[1] 国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.合格评定 化学分析方法确认和验证指南：GB/T 27417—2017[S].北京：中國标准出版社，2017.
[2] 国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.化学分析方法验证确认和内部质量控制实施指南 色谱分析：GB/T 35655—2017[S].北京：中国标准出版社，2018.
[3] 国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.实验室质量控制规范，食品理化检测：GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.
[4] 国家质量监督检验检疫总局，国家标准化管理委员会.化学分析方法验证确认和内部质量控制要求：GB/T 32465—2015[S].北京：中国标准出版社，2016.
[5] 农业部.农药残留检测方法国家标准编制指南（中华人民共和国农业部2386号公告）[EB/OL].（2016-04-11）[2021-05-20].http：//law.foodmate.net/show-188438.html.
[6] 农业部.兽药残留实验室质量控制规范：NY/T 1896-2010[S].北京：中国农业出版社，2010.
[7] 国家质量监督检验检疫总局.出口食品、化妆品理化测定方法标准编写的基本规定：SN/T 0001-2016[S].北京：中国标准出版社，2017.
[8] 郑卫东.化学分析实验室协同试验设计及统计分析手册[M].成都：四川科学技术出版社，2014：44-47.
（责任编辑：刘宁宁）