论文部分内容阅读
摘要
[目的] 通过化学方法合成一种新颖的HgDADPA柱，用于分离和富集植物及微生物体中硫硒修饰的化合物。[方法] 使用二氨基二异丙基琼脂糖（DADPA）与对氯汞苯甲酸进行反应，得到HgDADPA色谱柱，用不同浓度的盐酸洗脱不同位置取代的硫或硒化合物；然后，通过HgDADPA色谱富集大肠杆菌（E.coli）的tRNA中含硫、含硒化合物，并且鉴定。同时，测试HgDADPA色谱柱分离后样品回收率。[结果]合成的HgDADPA柱通过0.002、0.005、0.5 mol/L HCl 洗脱， 可以分离尿苷三磷酸（UTP）、2-硫代尿嘧啶（2SU）、2-硒代尿嘧啶（2SeU）和4-硒代尿苷三磷酸（4SeUTP）混合物，回收率均在90%以上。HgDADPA柱从大肠杆菌K12中选择性地富集到3个含硫修饰的核苷酸，经ESI和HRMS鉴定为鸟嘌呤2硫代尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤-3-硫代尿嘧啶核苷酸和鸟嘌呤-5-甲酰-2-尿嘧啶核苷酸。[结论] 合成的HgDADPA柱对含硒、含硫化合物有很好的分离效果，且可反复使用，从而为植物、微生物中含硒或硫有机化合物的富集、分离提供一个简便的分离材料。
关键词HgDADPA柱；对氯汞苯甲酸；含硫或硒修饰核苷酸；tRNA；分离
中图分类号S-03文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）24-012-05
研究植物及微生物体内生物大分子的结构修饰，对单一成分的纯化是一个重要且繁琐的过程。到目前为止，在组成总核糖核酸（tRNA）中共存在107种不同结构修饰的核苷。越来越多的化学和生物学领域的科学家对硫或硒修饰的tRNA及其功能感兴趣，已发现近23种不同的硫和硒核苷修饰的tRNA。到目前为止，研究微生物体DNA与RNA的硒和硫结构修饰大多使用同位素示踪法，虽然灵敏度高，但是其放射性限制其在一般实验室的应用。因此，合成新的分离材料一直是一个热点。已有报道表明，用交联葡萄糖凝胶色谱从消化过的核苷酸混合物中选择性地分离出4-和2-硫代尿嘧啶核苷。但是，目前还没有连接到对氯汞苯甲酸的报道。硫与硒在元素周期表中属于同一主族，因此其化学性质相似。如果某些载体能与硫结合，那么就能将含硒化合物分离。根据这个原则，笔者合成了一种新的汞柱，设计路线 见图1。
合成的HgDADPA色谱纯化化合物是一个可逆过程。通过不同浓度的HCl洗脱，将不同位置硫或硒修饰的核苷酸选择性地分离。该研究方法简单，成本低，不破坏化合物的稳定性。HgDADPA色谱的高选择性和高回收率可推广至天然产物中含硫、含硒化合物及未知化合物的富集和分离，为下一步鉴定提供样品。
1材料与方法
1.1仪器和试剂HRMASS质谱仪（美国Waters 公司）； ZWY200D 恒温培养振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司）。碳酸氢钠（NaHCO3）pH 8.8，偶联缓冲液（0.1 mol/L MES，浓度0.9%NaCl，pH 4.7），DADPA琼脂糖购买于Thermo公司；对氯汞苯甲酸、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和UTP购于Sigma公司；2-硫代尿嘧啶（2SU）、2-硒代尿嘧啶（2 SeU）和4-硒代尿嘧啶核苷（4SeUTP）由实验室提供。BaselineZEROTM DNase，RNase A，RiboShredderTM RNase Blend购买于Epicentre公司。
LB的组成：分别称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g氯化钠，加1 L双蒸水，定容，加热搅拌至溶解，灭菌后，在室温下放置，备用。
1.2HgDADPA 色谱的合成
取3 ml二氨基二异丙基琼脂糖DADPA（16～20 μmol 氨基/ml树脂），加入到0.5 cm × 8 cm 柱中（最后柱床高度1 cm），自由滴下，使存储的缓冲液耗尽后，分3次加入偶合缓冲液（0.1 mol/L MES，浓度09%NaCl，pH 4.7），每次3 ml，冲洗干净。在整个过程中，不要使树脂床干燥；平衡树脂，最后添加偶合缓冲液9 ml，转移DADPA琼脂糖至25 ml容量瓶中。取0.306 mmol对氯汞苯甲酸，溶解到6 ml二甲基甲酰胺中，混合几分钟，溶解后转移到25 ml容量瓶中。另取0.774 mmol的EDC 0.3 ml，溶解到偶合缓冲液中，然后加入装有树脂的圆底烧瓶中，在室温下搅拌，经过18 h反应，树脂转移到层析柱中，并且添加洗涤缓冲液（0.1 mol/L NaHCO3（pH=8.8）），洗涤至澄清，放至4 ℃保存，备用。
1.3HgDADPA色谱分离混合物
混合4UTP、UTP、2SU和2SeU，使用Hg- DADPA色谱柱分离。步骤如下：使用移液器分别取2 μl的 10 mmol/L UTP（A）、2SU（B）、2SeU（C）和4SeUTP（D），混合，然后加入1.8 ml双蒸水作为样品。使用Hg DADPA色谱分离样品，洗脱剂分别是0.1 mol/L NaHCO3、0.002 mol/L HCl、0.005 mol/L HCl和0.5 mol/L HCl，其中0.6 ml/管，每份洗脱的馏分都要通过紫外全波长扫描检测，合并相同样品。其中，在13管、14管之间加双蒸水10 ml，洗脱残存的碳酸氢钠。
A= ECL计算样品回收率（n=3）
1.4从大肠杆菌菌株K12（MG1665）提取tRNA
添加少量的大肠杆菌于LB中，4 ℃过夜，离心（6 000 r/min）8 min，弃上清液；留下约250 μl液体；加入含1 ml蛋白酶K组织和300 ml细胞裂解液，涡旋振荡5 min，65 ℃孵育120 min，再将样品置于冰上15 min，添加含175 ml的MPC蛋白沉淀试剂300 ml溶解样品，涡旋振荡1 min，4 ℃，离心（13 000 r/min）30 min；加入500 ml异丙醇，回收上清液；颠倒离心管30～40次，4 ℃离心20 min，小心倒出异丙醇；用浓度70%乙醇漂洗2次，不要接触沉淀；离心，用移液管取出所有残留的乙醇，得到总DNA和总RNA；加入6 ml不含RNA酶的游离水后，再加入Baseline ZEROTM DNase 200 μl（10×缓冲液，0.69 ml），37 ℃过夜；加入0.77 ml 3 mol/L NaCl，然后加入8 ml异丙醇，颠倒离心管30～40次；4 ℃，离心（3 000 r/min）30 min，得到tRNA。重复1次。 1.5tRNA的消化和含硫核苷酸化合物的富集
将tRNA重新溶于3 ml双蒸水中，加入0.5 ml 5 μg/μl的RNA酶A，混匀，并在37 ℃过夜孵育。然后，经HgDADPA色谱柱分离含硫或硒的核苷酸，洗脱剂分别是0.1 mol/L NaHCO3、0.002 mol/L HCl、0.005 mol/L HCl和0.5 mol/L HCl，其中0.6 ml/管，每份洗脱的馏分都要通过紫外全波长扫描检测，合并相同样品。
1.6含硫核苷酸化合物的鉴定
水解tRNA后，经过HgDADPA 色谱富集含硫、含硒核苷酸化合物，得到样品A和B，将样品经HPLC分析。HPLC条件如下：PRP1反相柱，流速1 ml/min， 柱温25 ℃， 流动相A为10 mmol/L TEAAc （pH 7.1），流动相B为含浓度60% CH3CN的10 mmol/L TEAAc （pH 7.1）。梯度洗脱，0～15 min 100% B， 16～20 min 100% A到30% B，检测波长260、326 nm。对HPLC的每个组分进行ESI （）MS和HRMS鉴定。
2结果与分析
2.1合成DADPAHg柱对混合物的分离和回收率测定
混合的UTP（A）、2SU（B）、2SeU（C）和4SeUTP（D）有不同的最大紫外吸收峰，分别为260、300、307、365 nm。柱层析洗脱次序见图2。重复3次，使用计算公式：A=ECL，计算样品回收率，式中A代表吸光度；E代表吸光系数；C代表浓度；L代表比色皿厚度。UTP、2SU、2SeU、4SeUTP的回收率分别约73%、87%、90%、85%（n= 3）。HgDADPA色谱柱能够高效地通过不同浓度的HCl洗脱剂分离不同含硫或硒的化合物，且可重复使用。
安徽农业科学2015年
2.2样品稳定性
由表1可知，室温放置4 d后，2-硒代尿嘧啶核苷比4-硒代尿嘧啶核苷稳定，在酸性条件下4-硒代尿嘧啶核苷几乎100%降解；硒取代的化合物在中性和碱性条件下比酸性条件下要稳定，其中在中性条件下化合物几乎没有发生降解，pH越低，化合物的稳定性越差。2-硒代胸腺嘧啶核苷和4-硒代胸腺嘧啶核苷具有同样的试验结果，即2位比4位稳定，在酸性条件下化合物具有不稳定性。
2.3未消化前提取大肠杆菌得到tRNA的总量和纯度从1 L大肠杆菌中提取得到9 ml的RNA，取2 μl稀释到800 μl水中，得到紫外图谱，计算A260/A280=1.96，表明RNA纯度达到90%以上。
2.4 tRNA的消化和含硫、含硒核苷酸化合物的富集
0.1 mol/L盐酸洗脱液在326 nm处有吸收（11～13管，样品A），0.5 mol/L盐酸洗脱液在326和260 nm处均有吸收（样品B），通过紫外检测，大致能够判断水解程度，A260/A326为4～10（样品B），判断RNA没有彻底水解，每个修饰上面大概平均
连接有4～6个未被修饰的碱基。由图3可知，所有馏分均
显示在256 nm处有吸收。这可能由于是核苷酸降解后产生
不完全水解。然而，11～13管均在326 nm处有强吸收，故此
合并作为样品A，将进一步分析326 nm峰的组成。
2.5样品A的鉴定与分离
2.5.1样品A的鉴定。
首先，以B2H6为还原剂，加入后发现没有造成任何紫外吸收峰的改变（图4）。但是，样品A对pH敏感，尤其是在碱性条件下。样品吸收峰在酸性条件下转变非常缓慢，而在碱性条件下pH改变吸收峰也迅速发生改变。根据吸收峰的数值，这些变化可能是硫取代的核苷（硫尿嘧啶核苷）造成的。因此，据预测，样品A主要是寡核苷酸，且含有硫尿嘧啶的结构。
2.5.2样品A的分离。
样品A经过高效液相分析，收集到6个不同的组分，前5个无色，第6个黄色（图5）。
2.5.3化合物鉴定。
对HPLC的每个组分进行ESI （-）MS and HRMS鉴定。通过ESI（-）MS（图6），分析所有的组分。684 m/z （M+-1）存在于后3个组分中，而668 m/z （M+-1）在6个组分中都存在，742 m/z （M+-1） 存在于后3个组分中。水解RNA的酶核糖核酸酶A（RNA酶A）是一个内源性的残留3′端嘧啶，最终形成3′-嘧啶-3′-磷酸寡居核苷酸，因此根据紫外吸收峰和HRMS，这2个峰分别对应到鸟嘌呤-2-硫代尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤-3-硫代尿嘧啶核苷酸和鸟嘌呤-5-甲酰-2-尿嘧啶核苷酸（表2、图7）。
3讨论
使用二氨基二异丙基琼脂糖（DADPA）与对氯汞苯甲酸进行反应，得到HgDADPA色谱。用不同浓度的盐酸洗脱不同位置取代的硫或硒修饰化合物。这个反应是一个可逆反应。当增加HCl用量时，被HgDADPA色谱反应结合的产物会被游离出来，从而被洗脱，而当更换成其他酸时，不能达到洗脱和分离。HgDADPA色谱对酸是稳定的，因此HgDADPA色谱的再生可以使用0.5 mol/L HCl洗脱除杂，从而活化。HgDADPA还具有一些优点，如可重用性和高可靠性、高回收率。试验结果显示，最低的回收率达80%以上。该研究材料将帮助含硫和含硒修饰的内源性大分子的富集，从而有助于进一步确定生物大分子的修饰位置。
使用合成的汞柱对来自大肠杆菌K12的tRNA中的含硫、含硒化合物分离，通过HRMS鉴定得到鸟嘌呤-2-硫代尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤-3-硫代尿嘧啶核苷酸和鸟嘌呤-5-甲酰-2-尿嘧啶核苷酸3个化合物。消化时使用RNA酶A，存在如下原因：核糖核酸酶A是一个内源性的核糖核酸酶，将最终水解得到3′-嘧啶-3′-磷酸根。分离、富集后在326 nm处的吸收峰是类似合成的4-硫尿嘧啶核苷酸（峰值在330 nm处）。根据这一特点，进一步通过ESIMS和HRMS确定大肠杆菌核苷酸的RNA的G4硫代尿嘧啶核苷酸、A3硫代尿嘧啶核苷酸及G5甲酰4硫代尿嘧啶核苷酸。然而，没有发现硒修饰核苷酸。可能的原因是已知的自然发生的硫和硒核苷在所有类型的RNA修饰中非常低，因此下一步将扩大培养。 总之，已合成新的HgDADPA色谱，可用于分离硫和硒修饰的RNA。这是一个经济和安全的纯化方法，具有重复性和选择性。2005年，上海交通大学的科学家已发现一种新的DNA修饰，即DNA修饰中含有硫。这在核酸的研究上属于里程碑的科学文件。这表明含有硒的DNA或RNA的修饰也可能存在于其他生物体中，或存在于更特殊的自然条件下生存的生物（如陨石坑的植物和微生物）。合成汞柱将有助于富集含硫含硒DNA或RNA修饰，使得检测简化，同时避免同位素对人体的伤害。今后，将使用这种新合成的HgDADPA色谱从天然植物中富集硫和硒衍生物。
参考文献
[1]
LIMBACH P A， CRAIN P F， MCCLOSKEY J A.Summary：The modified nucleosides of RNA[J].Nucleic Acids Res，1994，22（12）：2183-2196.
[2]CZERWONIEC A， DUNINHORKAWICZ S， PURTA E，et al.MODOMICS：A database of RNA modification pathways[J].Nucleic Acids Res， 2013，41：262-267.
[3]YU B， YANG Z， LI J，et al.Methylation as a crucial step in plant microRNA biogenesis[J].Science，2005，307：932-935.
[4]MCCLOSKEY J A，ROZENSKI J.The small subunit rRNA modification database[J].Nucleic Acids Res，2005，33：135-138.
[5]ROZENSKI J， CRAIN P F，MCCLOSKEY J A.The RNA modification database：1999 update[J].Nucleic Acids Res，1999，27：196-197.
[6]DUNINHORKAWICZ S， CZERWONIEC A， GAJDA M J，et al.MODOMICS：A database of RNA modification pathways[J].Nucleic Acids Res，2006，34：145-149.
[7] CANTARA W A，CRAIN P F，ROZENSKI J，et al.The RNA modification database， RNAMDB：2011 update[J].Nucleic Acids Research，2010，39：195-201.
[8] ONO M， KAWAKAMI M.Separation of newlysynthesized RNA by organomercurial agarose affinity chromatography[J].J Biochem，1977，81（5）：1247-1252.
[9] VAN DEN WYMELENBERG A， GASKELL J， MOZUCH M，et al.Comparative transcriptome and secretome analysis of wood decay fungi postia placenta and phanerochaete chrysosporium[J].Appl Environ Microbiol，2010，76（11）：3599-3610.
[10] ZHAO K， LIU M， BURGESS R R.Promoter and regulon analysis of nitrogen assimilation factor， sigma54， reveal alternative strategy for E.coli MG1655 flagellar biosynthesis[J].Nucleic Acids Res，2010，38（4）：1273-1283.
[11] ZHOU X， HE X， LIANG J，et al.A novel DNA modification by sulphur[J].Mol Microbiol，2005，57（5）：1428-1438.
[12] WANG L， CHEN S， XU T，et al.Phosphorothioation of DNA in bacteria by dnd genes[J].Nat Chem Biol，2007，3（11）：709-710.
[目的] 通过化学方法合成一种新颖的HgDADPA柱，用于分离和富集植物及微生物体中硫硒修饰的化合物。[方法] 使用二氨基二异丙基琼脂糖（DADPA）与对氯汞苯甲酸进行反应，得到HgDADPA色谱柱，用不同浓度的盐酸洗脱不同位置取代的硫或硒化合物；然后，通过HgDADPA色谱富集大肠杆菌（E.coli）的tRNA中含硫、含硒化合物，并且鉴定。同时，测试HgDADPA色谱柱分离后样品回收率。[结果]合成的HgDADPA柱通过0.002、0.005、0.5 mol/L HCl 洗脱， 可以分离尿苷三磷酸（UTP）、2-硫代尿嘧啶（2SU）、2-硒代尿嘧啶（2SeU）和4-硒代尿苷三磷酸（4SeUTP）混合物，回收率均在90%以上。HgDADPA柱从大肠杆菌K12中选择性地富集到3个含硫修饰的核苷酸，经ESI和HRMS鉴定为鸟嘌呤2硫代尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤-3-硫代尿嘧啶核苷酸和鸟嘌呤-5-甲酰-2-尿嘧啶核苷酸。[结论] 合成的HgDADPA柱对含硒、含硫化合物有很好的分离效果，且可反复使用，从而为植物、微生物中含硒或硫有机化合物的富集、分离提供一个简便的分离材料。
关键词HgDADPA柱；对氯汞苯甲酸；含硫或硒修饰核苷酸；tRNA；分离
中图分类号S-03文献标识码
A文章编号0517-6611（2015）24-012-05
研究植物及微生物体内生物大分子的结构修饰，对单一成分的纯化是一个重要且繁琐的过程。到目前为止，在组成总核糖核酸（tRNA）中共存在107种不同结构修饰的核苷。越来越多的化学和生物学领域的科学家对硫或硒修饰的tRNA及其功能感兴趣，已发现近23种不同的硫和硒核苷修饰的tRNA。到目前为止，研究微生物体DNA与RNA的硒和硫结构修饰大多使用同位素示踪法，虽然灵敏度高，但是其放射性限制其在一般实验室的应用。因此，合成新的分离材料一直是一个热点。已有报道表明，用交联葡萄糖凝胶色谱从消化过的核苷酸混合物中选择性地分离出4-和2-硫代尿嘧啶核苷。但是，目前还没有连接到对氯汞苯甲酸的报道。硫与硒在元素周期表中属于同一主族，因此其化学性质相似。如果某些载体能与硫结合，那么就能将含硒化合物分离。根据这个原则，笔者合成了一种新的汞柱，设计路线 见图1。
合成的HgDADPA色谱纯化化合物是一个可逆过程。通过不同浓度的HCl洗脱，将不同位置硫或硒修饰的核苷酸选择性地分离。该研究方法简单，成本低，不破坏化合物的稳定性。HgDADPA色谱的高选择性和高回收率可推广至天然产物中含硫、含硒化合物及未知化合物的富集和分离，为下一步鉴定提供样品。
1材料与方法
1.1仪器和试剂HRMASS质谱仪（美国Waters 公司）； ZWY200D 恒温培养振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司）。碳酸氢钠（NaHCO3）pH 8.8，偶联缓冲液（0.1 mol/L MES，浓度0.9%NaCl，pH 4.7），DADPA琼脂糖购买于Thermo公司；对氯汞苯甲酸、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和UTP购于Sigma公司；2-硫代尿嘧啶（2SU）、2-硒代尿嘧啶（2 SeU）和4-硒代尿嘧啶核苷（4SeUTP）由实验室提供。BaselineZEROTM DNase，RNase A，RiboShredderTM RNase Blend购买于Epicentre公司。
LB的组成：分别称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g氯化钠，加1 L双蒸水，定容，加热搅拌至溶解，灭菌后，在室温下放置，备用。
1.2HgDADPA 色谱的合成
取3 ml二氨基二异丙基琼脂糖DADPA（16～20 μmol 氨基/ml树脂），加入到0.5 cm × 8 cm 柱中（最后柱床高度1 cm），自由滴下，使存储的缓冲液耗尽后，分3次加入偶合缓冲液（0.1 mol/L MES，浓度09%NaCl，pH 4.7），每次3 ml，冲洗干净。在整个过程中，不要使树脂床干燥；平衡树脂，最后添加偶合缓冲液9 ml，转移DADPA琼脂糖至25 ml容量瓶中。取0.306 mmol对氯汞苯甲酸，溶解到6 ml二甲基甲酰胺中，混合几分钟，溶解后转移到25 ml容量瓶中。另取0.774 mmol的EDC 0.3 ml，溶解到偶合缓冲液中，然后加入装有树脂的圆底烧瓶中，在室温下搅拌，经过18 h反应，树脂转移到层析柱中，并且添加洗涤缓冲液（0.1 mol/L NaHCO3（pH=8.8）），洗涤至澄清，放至4 ℃保存，备用。
1.3HgDADPA色谱分离混合物
混合4UTP、UTP、2SU和2SeU，使用Hg- DADPA色谱柱分离。步骤如下：使用移液器分别取2 μl的 10 mmol/L UTP（A）、2SU（B）、2SeU（C）和4SeUTP（D），混合，然后加入1.8 ml双蒸水作为样品。使用Hg DADPA色谱分离样品，洗脱剂分别是0.1 mol/L NaHCO3、0.002 mol/L HCl、0.005 mol/L HCl和0.5 mol/L HCl，其中0.6 ml/管，每份洗脱的馏分都要通过紫外全波长扫描检测，合并相同样品。其中，在13管、14管之间加双蒸水10 ml，洗脱残存的碳酸氢钠。
A= ECL计算样品回收率（n=3）
1.4从大肠杆菌菌株K12（MG1665）提取tRNA
添加少量的大肠杆菌于LB中，4 ℃过夜，离心（6 000 r/min）8 min，弃上清液；留下约250 μl液体；加入含1 ml蛋白酶K组织和300 ml细胞裂解液，涡旋振荡5 min，65 ℃孵育120 min，再将样品置于冰上15 min，添加含175 ml的MPC蛋白沉淀试剂300 ml溶解样品，涡旋振荡1 min，4 ℃，离心（13 000 r/min）30 min；加入500 ml异丙醇，回收上清液；颠倒离心管30～40次，4 ℃离心20 min，小心倒出异丙醇；用浓度70%乙醇漂洗2次，不要接触沉淀；离心，用移液管取出所有残留的乙醇，得到总DNA和总RNA；加入6 ml不含RNA酶的游离水后，再加入Baseline ZEROTM DNase 200 μl（10×缓冲液，0.69 ml），37 ℃过夜；加入0.77 ml 3 mol/L NaCl，然后加入8 ml异丙醇，颠倒离心管30～40次；4 ℃，离心（3 000 r/min）30 min，得到tRNA。重复1次。 1.5tRNA的消化和含硫核苷酸化合物的富集
将tRNA重新溶于3 ml双蒸水中，加入0.5 ml 5 μg/μl的RNA酶A，混匀，并在37 ℃过夜孵育。然后，经HgDADPA色谱柱分离含硫或硒的核苷酸，洗脱剂分别是0.1 mol/L NaHCO3、0.002 mol/L HCl、0.005 mol/L HCl和0.5 mol/L HCl，其中0.6 ml/管，每份洗脱的馏分都要通过紫外全波长扫描检测，合并相同样品。
1.6含硫核苷酸化合物的鉴定
水解tRNA后，经过HgDADPA 色谱富集含硫、含硒核苷酸化合物，得到样品A和B，将样品经HPLC分析。HPLC条件如下：PRP1反相柱，流速1 ml/min， 柱温25 ℃， 流动相A为10 mmol/L TEAAc （pH 7.1），流动相B为含浓度60% CH3CN的10 mmol/L TEAAc （pH 7.1）。梯度洗脱，0～15 min 100% B， 16～20 min 100% A到30% B，检测波长260、326 nm。对HPLC的每个组分进行ESI （）MS和HRMS鉴定。
2结果与分析
2.1合成DADPAHg柱对混合物的分离和回收率测定
混合的UTP（A）、2SU（B）、2SeU（C）和4SeUTP（D）有不同的最大紫外吸收峰，分别为260、300、307、365 nm。柱层析洗脱次序见图2。重复3次，使用计算公式：A=ECL，计算样品回收率，式中A代表吸光度；E代表吸光系数；C代表浓度；L代表比色皿厚度。UTP、2SU、2SeU、4SeUTP的回收率分别约73%、87%、90%、85%（n= 3）。HgDADPA色谱柱能够高效地通过不同浓度的HCl洗脱剂分离不同含硫或硒的化合物，且可重复使用。
安徽农业科学2015年
2.2样品稳定性
由表1可知，室温放置4 d后，2-硒代尿嘧啶核苷比4-硒代尿嘧啶核苷稳定，在酸性条件下4-硒代尿嘧啶核苷几乎100%降解；硒取代的化合物在中性和碱性条件下比酸性条件下要稳定，其中在中性条件下化合物几乎没有发生降解，pH越低，化合物的稳定性越差。2-硒代胸腺嘧啶核苷和4-硒代胸腺嘧啶核苷具有同样的试验结果，即2位比4位稳定，在酸性条件下化合物具有不稳定性。
2.3未消化前提取大肠杆菌得到tRNA的总量和纯度从1 L大肠杆菌中提取得到9 ml的RNA，取2 μl稀释到800 μl水中，得到紫外图谱，计算A260/A280=1.96，表明RNA纯度达到90%以上。
2.4 tRNA的消化和含硫、含硒核苷酸化合物的富集
0.1 mol/L盐酸洗脱液在326 nm处有吸收（11～13管，样品A），0.5 mol/L盐酸洗脱液在326和260 nm处均有吸收（样品B），通过紫外检测，大致能够判断水解程度，A260/A326为4～10（样品B），判断RNA没有彻底水解，每个修饰上面大概平均
连接有4～6个未被修饰的碱基。由图3可知，所有馏分均
显示在256 nm处有吸收。这可能由于是核苷酸降解后产生
不完全水解。然而，11～13管均在326 nm处有强吸收，故此
合并作为样品A，将进一步分析326 nm峰的组成。
2.5样品A的鉴定与分离
2.5.1样品A的鉴定。
首先，以B2H6为还原剂，加入后发现没有造成任何紫外吸收峰的改变（图4）。但是，样品A对pH敏感，尤其是在碱性条件下。样品吸收峰在酸性条件下转变非常缓慢，而在碱性条件下pH改变吸收峰也迅速发生改变。根据吸收峰的数值，这些变化可能是硫取代的核苷（硫尿嘧啶核苷）造成的。因此，据预测，样品A主要是寡核苷酸，且含有硫尿嘧啶的结构。
2.5.2样品A的分离。
样品A经过高效液相分析，收集到6个不同的组分，前5个无色，第6个黄色（图5）。
2.5.3化合物鉴定。
对HPLC的每个组分进行ESI （-）MS and HRMS鉴定。通过ESI（-）MS（图6），分析所有的组分。684 m/z （M+-1）存在于后3个组分中，而668 m/z （M+-1）在6个组分中都存在，742 m/z （M+-1） 存在于后3个组分中。水解RNA的酶核糖核酸酶A（RNA酶A）是一个内源性的残留3′端嘧啶，最终形成3′-嘧啶-3′-磷酸寡居核苷酸，因此根据紫外吸收峰和HRMS，这2个峰分别对应到鸟嘌呤-2-硫代尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤-3-硫代尿嘧啶核苷酸和鸟嘌呤-5-甲酰-2-尿嘧啶核苷酸（表2、图7）。
3讨论
使用二氨基二异丙基琼脂糖（DADPA）与对氯汞苯甲酸进行反应，得到HgDADPA色谱。用不同浓度的盐酸洗脱不同位置取代的硫或硒修饰化合物。这个反应是一个可逆反应。当增加HCl用量时，被HgDADPA色谱反应结合的产物会被游离出来，从而被洗脱，而当更换成其他酸时，不能达到洗脱和分离。HgDADPA色谱对酸是稳定的，因此HgDADPA色谱的再生可以使用0.5 mol/L HCl洗脱除杂，从而活化。HgDADPA还具有一些优点，如可重用性和高可靠性、高回收率。试验结果显示，最低的回收率达80%以上。该研究材料将帮助含硫和含硒修饰的内源性大分子的富集，从而有助于进一步确定生物大分子的修饰位置。
使用合成的汞柱对来自大肠杆菌K12的tRNA中的含硫、含硒化合物分离，通过HRMS鉴定得到鸟嘌呤-2-硫代尿嘧啶核苷酸、腺嘌呤-3-硫代尿嘧啶核苷酸和鸟嘌呤-5-甲酰-2-尿嘧啶核苷酸3个化合物。消化时使用RNA酶A，存在如下原因：核糖核酸酶A是一个内源性的核糖核酸酶，将最终水解得到3′-嘧啶-3′-磷酸根。分离、富集后在326 nm处的吸收峰是类似合成的4-硫尿嘧啶核苷酸（峰值在330 nm处）。根据这一特点，进一步通过ESIMS和HRMS确定大肠杆菌核苷酸的RNA的G4硫代尿嘧啶核苷酸、A3硫代尿嘧啶核苷酸及G5甲酰4硫代尿嘧啶核苷酸。然而，没有发现硒修饰核苷酸。可能的原因是已知的自然发生的硫和硒核苷在所有类型的RNA修饰中非常低，因此下一步将扩大培养。 总之，已合成新的HgDADPA色谱，可用于分离硫和硒修饰的RNA。这是一个经济和安全的纯化方法，具有重复性和选择性。2005年，上海交通大学的科学家已发现一种新的DNA修饰，即DNA修饰中含有硫。这在核酸的研究上属于里程碑的科学文件。这表明含有硒的DNA或RNA的修饰也可能存在于其他生物体中，或存在于更特殊的自然条件下生存的生物（如陨石坑的植物和微生物）。合成汞柱将有助于富集含硫含硒DNA或RNA修饰，使得检测简化，同时避免同位素对人体的伤害。今后，将使用这种新合成的HgDADPA色谱从天然植物中富集硫和硒衍生物。
参考文献
[1]
LIMBACH P A， CRAIN P F， MCCLOSKEY J A.Summary：The modified nucleosides of RNA[J].Nucleic Acids Res，1994，22（12）：2183-2196.
[2]CZERWONIEC A， DUNINHORKAWICZ S， PURTA E，et al.MODOMICS：A database of RNA modification pathways[J].Nucleic Acids Res， 2013，41：262-267.
[3]YU B， YANG Z， LI J，et al.Methylation as a crucial step in plant microRNA biogenesis[J].Science，2005，307：932-935.
[4]MCCLOSKEY J A，ROZENSKI J.The small subunit rRNA modification database[J].Nucleic Acids Res，2005，33：135-138.
[5]ROZENSKI J， CRAIN P F，MCCLOSKEY J A.The RNA modification database：1999 update[J].Nucleic Acids Res，1999，27：196-197.
[6]DUNINHORKAWICZ S， CZERWONIEC A， GAJDA M J，et al.MODOMICS：A database of RNA modification pathways[J].Nucleic Acids Res，2006，34：145-149.
[7] CANTARA W A，CRAIN P F，ROZENSKI J，et al.The RNA modification database， RNAMDB：2011 update[J].Nucleic Acids Research，2010，39：195-201.
[8] ONO M， KAWAKAMI M.Separation of newlysynthesized RNA by organomercurial agarose affinity chromatography[J].J Biochem，1977，81（5）：1247-1252.
[9] VAN DEN WYMELENBERG A， GASKELL J， MOZUCH M，et al.Comparative transcriptome and secretome analysis of wood decay fungi postia placenta and phanerochaete chrysosporium[J].Appl Environ Microbiol，2010，76（11）：3599-3610.
[10] ZHAO K， LIU M， BURGESS R R.Promoter and regulon analysis of nitrogen assimilation factor， sigma54， reveal alternative strategy for E.coli MG1655 flagellar biosynthesis[J].Nucleic Acids Res，2010，38（4）：1273-1283.
[11] ZHOU X， HE X， LIANG J，et al.A novel DNA modification by sulphur[J].Mol Microbiol，2005，57（5）：1428-1438.
[12] WANG L， CHEN S， XU T，et al.Phosphorothioation of DNA in bacteria by dnd genes[J].Nat Chem Biol，2007，3（11）：709-710.