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[摘要] 目的 研究白细胞介素-10（IL-10）在反复自然流产患者绒毛及蜕膜组织中的表达情况。 方法 应用免疫组织化学染色和图像分析技术，分别对30例反复自然流产患者（实验组）和30例正常妊娠者（对照组）绒毛和蜕膜组织中的表达进行定位和半定量分析。 结果 免疫组织化学显色显示，在绒毛组织中IL-10蛋白定位于滋养层的细胞质内，且实验组的IL-10蛋白表达明显低于对照组（P<0.01）；在蜕膜组织中IL-10蛋白定位于蜕膜细胞和腺上皮细胞的细胞质内，且实验组的IL-10蛋白表达明显低于对照组（P<0.01）。 结论 实验组绒毛和蜕膜组织中IL-10蛋白的低表达与反复自然流产有关，可能参与反复自然流产的病理过程。
[关键词] 白细胞介素-10；反复自然流产；绒毛；蜕膜
[中图分类号] R714.21 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）21-11-03
反复自然流产是一种常见的妊娠并发症，发病原因极其复杂，约50%的患者病因不明，已被公认与免疫有关 [1]，其中Th1/Th2细胞因子与反复自然流产关系密切[2-3]。白细胞介素-10（IL-10）是一类主要由Th2细胞分泌的细胞因子，国内外已有不少学者研究了反复自然流产患者外周血中IL-10的变化[4-6]，关于反复自然流产患者蜕膜和绒毛组织中IL-10蛋白表达的研究不多。我们的研究对反复自然流产患者蜕膜、绒毛组织中IL-10的蛋白表达进行定位和半定量分析，以进一步探讨自然流产发生的免疫机制，为临床治疗提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2010年3月～2011年2月在包头医学院附属医院妇产科门诊就诊的反复自然流产患者30例作为实验组，年龄22～40岁，平均（28.8±6.3）岁。实验组入选标准：既往2次或以上自然流产病史；无染色体、解剖、内分泌异常和感染、自身免疫性疾病。随机选取同期正常早孕的人工流产者30例作为对照组，年龄20～38岁，平均（27.5±5.3）岁，孕龄6～10周，既往均有生育健康子女，无自然流产、死胎、死产史，B超提示胚胎发育正常，无染色体疾病和其他系统疾病。收集刮宫后绒毛和蜕膜组织，生理盐水清洗样本，然后用10%甲醛溶液固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋制成蜡块保存。
1.2 主要试剂
免疫组化SABC试剂盒，兔抗人IL-10多克隆抗体， DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 免疫组织化学染色
将蜡块切为6μm厚的组织切片，经脱蜡和水化；0.3%双氧水-甲醇室温孵育20min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min，使抗原位点暴露出来；滴加兔抗人IL-10抗体工作液（1︰100），阴性对照用PBS代替一抗，4℃过夜；加二抗后置于37℃温箱中30min；加SABC后置于37℃温箱中30min；DAB- H2O2室温显色，苏木素复染细胞核，脱水、透明、封片。
1.4 图像处理
实验组和对照组各30例，每例取绒毛组织切片和蜕膜组织切片各2张，应用捷达801图像分析系统进行分析，分别于绒毛组织的滋养层细胞、蜕膜组织的蜕膜细胞、腺上皮细胞随机取2个单位面积，测量平均光密度作为测量数据。
1.5 统计学分析
数据采用SPSS10.0软件进行统计分析，计算平均值与标准差，结果以（）表示，实验组与对照组组间进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 IL-10蛋白在绒毛和蜕膜中的组织学定位
在蜕膜组织中，实验组和对照组的蜕膜细胞和腺上皮细胞胞质内均有棕黄色阳性反应颗粒。在绒毛组织中，实验组和对照组IL-10蛋白的表达主要定位于绒毛滋养层细胞的胞质内，呈综黄色颗粒，两组阳性反应强弱不等。见图1～4。
2.2 IL-10蛋白在绒毛和蜕膜中的半定量结果
在蜕膜组织中，实验组IL-10的蛋白含量相对降低，与对照组比较有显著差异（P<0.01）；在绒毛组织中，实验组IL-10蛋白在滋养层细胞的相对含量明显降低，与对照组相比有显著性差异（P<0.01）。见表1。
3 讨论
目前许多研究结果表明T辅助细胞亚型Th1、Th2 细胞因子平衡与妊娠结局密切相关。正常妊娠表现为一种特殊的Th2现象，Th1处于一种抑制状态，当发生向Th1型细胞因子的偏离时，可能会导致自然流产[7-8]。
IL-10是一类主要由Th2细胞分泌的具有抗炎和抗过敏作用的细胞因子， 具有蜕膜组织的抗炎和抑制免疫活性的作用。近年来的研究发现， IL-10与妊娠的生理病理过程有密切的联系。Izzo研究显示在妊娠早期IL-10与子宫内膜对胚胎植入的容受性形成有关，防止对滋养层细胞和胎儿的继发损伤，维持了正常妊娠的顺利进行[9]。邵剑春等[10]研究发现正常妊娠者外周血的IL-10高于非妊娠者，而反复自然流产患者外周血的IL-10水平低于健康组。本实验显示IL-10蛋白主要定位于绒毛组织的滋养层细胞及蜕膜组织的蜕膜细胞、腺上皮细胞的细胞质内，在反复自然流产者的绒毛组织和蜕膜组织中IL-10蛋白表达相对含量明显低于正常妊娠妇女，其结果与李静等[11-12]研究结果一致，反复自然流产患者早孕绒毛组织及蜕膜组织IL-10表达的下降，可能使细胞免疫增强，滋养层细胞植入异常，影响胚胎的正常发育，而导致早期自然流产。
本研究表明IL-10蛋白在绒毛及蜕膜组织中的低表达与流产的发生有关，为反复自然流产发病免疫学说提供了证据，能否通过加入IL-10细胞因子，调节免疫平衡以减少流产的发生，有待于进一步探索。
[参考文献] [1] 冯晓玲，陈璐，赵颜.复发性流产的病因学研究进展[J].中国医疗前沿，2012，7（7）：14-15.
[2] Jonsson Y，Ekerfelt C，Berg G，et al.Systemic Th1/Th2 cytokine responsestopater naland vaccination antigens inpreeclampsia：no differences compared with normal pregnancy[J].AmJ Reprod Immunol，2004，51（4）：302.
[3] 吕兴钰，艾海权，蔡霞，等.正常妊娠反复自然流产绒毛及蜕膜组织中细胞因子信号转导负调控因子的表达：改变平衡调节可影响妊娠结局[J].中国组织工程研究，2012，16（18）：3333-3336.
[4] 刘庆芝，黄山鹰，姚吉龙，等.反复自然流产患者外周血中型细胞因子的表达及其意义[J].东南大学学报，2011，30（4）：565-568.
[5] Paradisi R，Porcu E，Venturoli S，et al.Maternal serum levels of proinflammatory cytok-ines in missed and threatened abortion [J].Am JReprod Immunol，2003，50（4）：302.
[6] 黄江宁，赵期菊，刘琼芬，等.孕妇IL-8、IL-10血清学水平与早期自然流产的相关性研究[J].中国优生与遗传杂志，2009，17（10）：76-77.
[7] MadhappanB，KempurajD，ChristodoulouS，et al.High levels of intrauterine corticotropin-releasing hormone， urocortin，tryptase，and interleukin-8 in spontaneous abortions[J].Endocrinol，2003，144（6）：2285-2290.
[8] Liu F，Luo SP.Effect of Chinese herbal treatment on Th1-and Th2-type cytokines， progesterone and beta-human chorionic gonadotropin in early pregnant women of threatened abortion[J]. Chin J Integr Med，2009，15（5）：353-358.
[9] Izzo R，Hviid TV，Stignani M，et al.heHLA- Ggenotype is asso-ciat-ed with IL-10 levels in activated PBMC[J].Immunogenetics，2005，57（ 3-4）：172-181.
[10] 邵剑春，胡大春，陈俊，等.原因不明习惯性流产与细胞因子免疫平衡的相关性[J].检验医学与临床，2012，9（5）：568-569.
[11] 李静，杨洋，张永爱，等.IL-10在反复自然流产人绒毛组织的表达及意义[J].细胞与分子免疫学杂志，2011，27（10）：1065-1071.
[12] 齐卫红，蒋凤兰，詹瑛.IL-10、IL-8在习惯性流产患者外周血及母胎界面中的表达[J].现代医药卫生，2006，22（11）：1599-1600.
（收稿日期：2013-08-20）
[关键词] 白细胞介素-10；反复自然流产；绒毛；蜕膜
[中图分类号] R714.21 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）21-11-03
反复自然流产是一种常见的妊娠并发症，发病原因极其复杂，约50%的患者病因不明，已被公认与免疫有关 [1]，其中Th1/Th2细胞因子与反复自然流产关系密切[2-3]。白细胞介素-10（IL-10）是一类主要由Th2细胞分泌的细胞因子，国内外已有不少学者研究了反复自然流产患者外周血中IL-10的变化[4-6]，关于反复自然流产患者蜕膜和绒毛组织中IL-10蛋白表达的研究不多。我们的研究对反复自然流产患者蜕膜、绒毛组织中IL-10的蛋白表达进行定位和半定量分析，以进一步探讨自然流产发生的免疫机制，为临床治疗提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2010年3月～2011年2月在包头医学院附属医院妇产科门诊就诊的反复自然流产患者30例作为实验组，年龄22～40岁，平均（28.8±6.3）岁。实验组入选标准：既往2次或以上自然流产病史；无染色体、解剖、内分泌异常和感染、自身免疫性疾病。随机选取同期正常早孕的人工流产者30例作为对照组，年龄20～38岁，平均（27.5±5.3）岁，孕龄6～10周，既往均有生育健康子女，无自然流产、死胎、死产史，B超提示胚胎发育正常，无染色体疾病和其他系统疾病。收集刮宫后绒毛和蜕膜组织，生理盐水清洗样本，然后用10%甲醛溶液固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋制成蜡块保存。
1.2 主要试剂
免疫组化SABC试剂盒，兔抗人IL-10多克隆抗体， DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 免疫组织化学染色
将蜡块切为6μm厚的组织切片，经脱蜡和水化；0.3%双氧水-甲醇室温孵育20min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min，使抗原位点暴露出来；滴加兔抗人IL-10抗体工作液（1︰100），阴性对照用PBS代替一抗，4℃过夜；加二抗后置于37℃温箱中30min；加SABC后置于37℃温箱中30min；DAB- H2O2室温显色，苏木素复染细胞核，脱水、透明、封片。
1.4 图像处理
实验组和对照组各30例，每例取绒毛组织切片和蜕膜组织切片各2张，应用捷达801图像分析系统进行分析，分别于绒毛组织的滋养层细胞、蜕膜组织的蜕膜细胞、腺上皮细胞随机取2个单位面积，测量平均光密度作为测量数据。
1.5 统计学分析
数据采用SPSS10.0软件进行统计分析，计算平均值与标准差，结果以（）表示，实验组与对照组组间进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 IL-10蛋白在绒毛和蜕膜中的组织学定位
在蜕膜组织中，实验组和对照组的蜕膜细胞和腺上皮细胞胞质内均有棕黄色阳性反应颗粒。在绒毛组织中，实验组和对照组IL-10蛋白的表达主要定位于绒毛滋养层细胞的胞质内，呈综黄色颗粒，两组阳性反应强弱不等。见图1～4。
2.2 IL-10蛋白在绒毛和蜕膜中的半定量结果
在蜕膜组织中，实验组IL-10的蛋白含量相对降低，与对照组比较有显著差异（P<0.01）；在绒毛组织中，实验组IL-10蛋白在滋养层细胞的相对含量明显降低，与对照组相比有显著性差异（P<0.01）。见表1。
3 讨论
目前许多研究结果表明T辅助细胞亚型Th1、Th2 细胞因子平衡与妊娠结局密切相关。正常妊娠表现为一种特殊的Th2现象，Th1处于一种抑制状态，当发生向Th1型细胞因子的偏离时，可能会导致自然流产[7-8]。
IL-10是一类主要由Th2细胞分泌的具有抗炎和抗过敏作用的细胞因子， 具有蜕膜组织的抗炎和抑制免疫活性的作用。近年来的研究发现， IL-10与妊娠的生理病理过程有密切的联系。Izzo研究显示在妊娠早期IL-10与子宫内膜对胚胎植入的容受性形成有关，防止对滋养层细胞和胎儿的继发损伤，维持了正常妊娠的顺利进行[9]。邵剑春等[10]研究发现正常妊娠者外周血的IL-10高于非妊娠者，而反复自然流产患者外周血的IL-10水平低于健康组。本实验显示IL-10蛋白主要定位于绒毛组织的滋养层细胞及蜕膜组织的蜕膜细胞、腺上皮细胞的细胞质内，在反复自然流产者的绒毛组织和蜕膜组织中IL-10蛋白表达相对含量明显低于正常妊娠妇女，其结果与李静等[11-12]研究结果一致，反复自然流产患者早孕绒毛组织及蜕膜组织IL-10表达的下降，可能使细胞免疫增强，滋养层细胞植入异常，影响胚胎的正常发育，而导致早期自然流产。
本研究表明IL-10蛋白在绒毛及蜕膜组织中的低表达与流产的发生有关，为反复自然流产发病免疫学说提供了证据，能否通过加入IL-10细胞因子，调节免疫平衡以减少流产的发生，有待于进一步探索。
[参考文献] [1] 冯晓玲，陈璐，赵颜.复发性流产的病因学研究进展[J].中国医疗前沿，2012，7（7）：14-15.
[2] Jonsson Y，Ekerfelt C，Berg G，et al.Systemic Th1/Th2 cytokine responsestopater naland vaccination antigens inpreeclampsia：no differences compared with normal pregnancy[J].AmJ Reprod Immunol，2004，51（4）：302.
[3] 吕兴钰，艾海权，蔡霞，等.正常妊娠反复自然流产绒毛及蜕膜组织中细胞因子信号转导负调控因子的表达：改变平衡调节可影响妊娠结局[J].中国组织工程研究，2012，16（18）：3333-3336.
[4] 刘庆芝，黄山鹰，姚吉龙，等.反复自然流产患者外周血中型细胞因子的表达及其意义[J].东南大学学报，2011，30（4）：565-568.
[5] Paradisi R，Porcu E，Venturoli S，et al.Maternal serum levels of proinflammatory cytok-ines in missed and threatened abortion [J].Am JReprod Immunol，2003，50（4）：302.
[6] 黄江宁，赵期菊，刘琼芬，等.孕妇IL-8、IL-10血清学水平与早期自然流产的相关性研究[J].中国优生与遗传杂志，2009，17（10）：76-77.
[7] MadhappanB，KempurajD，ChristodoulouS，et al.High levels of intrauterine corticotropin-releasing hormone， urocortin，tryptase，and interleukin-8 in spontaneous abortions[J].Endocrinol，2003，144（6）：2285-2290.
[8] Liu F，Luo SP.Effect of Chinese herbal treatment on Th1-and Th2-type cytokines， progesterone and beta-human chorionic gonadotropin in early pregnant women of threatened abortion[J]. Chin J Integr Med，2009，15（5）：353-358.
[9] Izzo R，Hviid TV，Stignani M，et al.heHLA- Ggenotype is asso-ciat-ed with IL-10 levels in activated PBMC[J].Immunogenetics，2005，57（ 3-4）：172-181.
[10] 邵剑春，胡大春，陈俊，等.原因不明习惯性流产与细胞因子免疫平衡的相关性[J].检验医学与临床，2012，9（5）：568-569.
[11] 李静，杨洋，张永爱，等.IL-10在反复自然流产人绒毛组织的表达及意义[J].细胞与分子免疫学杂志，2011，27（10）：1065-1071.
[12] 齐卫红，蒋凤兰，詹瑛.IL-10、IL-8在习惯性流产患者外周血及母胎界面中的表达[J].现代医药卫生，2006，22（11）：1599-1600.
（收稿日期：2013-08-20）