论文部分内容阅读
[摘要] 目的 觀察医用臭氧在兔膝骨关节炎中的应用及对关节滑液中肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL-1β）、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）水平的影响。 方法 取新西兰大白兔60只，采用改良Hulth法建立兔膝骨关节炎模型。根据处理方法不同分为空白对照组（n=20）、对照组（n=20）及观察组（n=20）。空白对照组不采取任何方法处理，对照组灌服生理盐水治疗，观察组采用医用臭氧治疗。采用酶联免疫吸附试验测定三组治疗前后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平，比较三组治疗效果。 结果 观察组大白兔采用医用臭氧进行6周处理后关节软骨光泽明亮，光滑无裂纹，滑膜为白色、光泽、光滑，滑液量相对较少，无色；对照组新西兰大白兔局部软化，部分大白兔出血溃疡，滑膜充血、水肿，并且滑液量相对较多。三组处理前TNF-α、IL-1β、MMP-1水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；观察组处理后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平低于对照组和空白对照组（P<0.05），对照组处理后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平低于空白对照组（P<0.05）。 结论 采用医用臭氧治疗兔膝骨关节炎效果理想，能降低关节滑液中TNF-α、IL-1β、MMP-1水平。
[关键词] 医用臭氧；兔膝骨关节炎；关节滑液；TNF-α；IL-1β；MMP-1
[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）34-0004-04
Effect of medical ozone on the levels of inflammatory factors of knee osteoarthritis in rabbits
CHEN Xiaogang LV Yi LI Guijin ZENG Yuqing
Department of Orthopedics， the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， China
[Abstract] Objective To observe the application of medical ozone in rabbit knee osteoarthritis and to investigate its effect on the levels of tumor necrosis factor （TNF-α）， interleukin （IL-1β） and matrix metalloproteinase-1（MMP-1） in synovial fluid. Methods 60 New Zealand white rabbits were collected， and the model of rabbit knee osteoarthritis was established by modified Hulth method. They were assigned to the blank control group （n=20）， the control group （n=20） and the observation group（n=20） according to the different treatment methods. The blank control group was not given any treatment method， the control group was orally given normal saline， and the observation group was treated with medical ozone. The level of TNF-α， IL-1β and MMP-1 in the three groups before and after treatment were measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. The curative effect was compared among three groups. Results The rabbits in the observation group were treated with medical ozone for 6 weeks. The articular cartilage was bright and smooth without cracks. The synovium was white， shiny， and smooth. The amount of synovial fluid was relatively small and colorless. The local part was softened in the New Zealand rabbits in the control group. Hemorrhage ulcer， synovial congestion and edema could be observed in some rabbits， and the amount of synovial fluid was relatively much； there was no statistically significant difference in the levels of TNF-α， IL-1β and MMP-1 among three groups before the treatment（P>0.05）； the levels of TNF-α， IL-1β and MMP-1 in the observation group after treatment were lower than those in the control group and the blank control group（P<0.05）. The levels of TNF-α， IL-1β and MMP-1 in the control group after the treatment were lower than those in the blank control group（P<0.05）. Conclusion The therapeutic effect of medical ozone in the treatment of knee osteoarthritis is ideal， which can decrease the levels of TNF-α， IL-1β and MMP-1 in synovial fluid. [Key words] Medical ozone； Rabbit knee osteoarthritis； Synovial fluid； TNF-α； IL-1β； MMP-1
骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是临床上常见的疾病，该疾病属于退行性骨关节病，具有较高的发病率、致残率，患者发病后如果不采取有效的方法治疗，将会诱发其他疾病，严重影响患者生活质量[1]。目前，临床上对于OA以对症支持治疗、关节镜清理、人工关节置换术为主，这些方法虽然能改善患者症状，但是长期疗效欠佳，手术治疗费用相对较高，治疗适应证较窄，难以满足每位患者治疗需要[2，3]。文献报道显示[4，5]，近年来注射疗法因其具有较好的疗效、相对减轻全身用药后对身体的副作用少及较低的费用而发展迅速，已广泛应用于临床，其中医用臭氧在OA患者中效果理想，该方法能有效改善机体症状，促进机体恢复，但是其具体机制尚不完全知晓。为探讨医用臭氧在兔膝骨关节炎中的应用及对关节滑液中肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL-1β）、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）水平的影响，选取2015年1月～2016年7月校动物实验室的新西兰大白兔60只进行试验，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
取新西兰大白兔60只，根据处理方法不同分为空白对照组（n=20）、对照组（n=20）及观察组（n=20），雌雄随机，体重1.6～3.0 kg，平均（2.3±0.4）kg，所选动物由校动物实验中心提供，动物批号[（2014）120482551]。实验过程中对新西兰大白兔饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导性意见》相关规则。所有试验均通过医院动物委员会批准同意。
1.2 主要仪器和试剂
为保证试验的顺利完成，采用的主要仪器和试剂有动物手术器械一套（实验室前期自制）、-70℃超低温冰箱（实验室提供）、超净工作台（日本Olympus公司）、低速冷冻离心机（北京鼎国生物公司）、离心管、微量加样器（实验室提供）。
1.3 方法
1.3.1 模型的建立 三组均在两侧膝关节实施手术，采用改良Hulth法建立兔膝骨关节炎模型，建立模型前采用0.1 mg/kg、浓度为2%的戊巴比妥钠进行耳缘静脉麻醉，术区备皮，常规消毒后，行膝内侧纵行切口，逐层切开后充分暴露内侧副韧带，切开关节囊，将兔内侧副韧带、内侧半月板及前交叉韧带切断，建立兔膝骨关节炎模型。术后新西兰大白兔分笼饲养，不固定伤肢，每只大白兔建立模型后注射40万单位青霉素，连续注射3 d预防感染[6，7]。
1.3.2 处理方法 三组大白兔建立模型后7 d开始实施相应的方法处理。空白对照组不采取任何方法处理。对照组灌服生理盐水治疗，对大白兔每天灌服10 mL生理盐水，每天3次，连续灌服6周（1个疗程）。观察组采用医用臭氧治疗，新西兰大白兔仰卧在操作台上，膝关节下垫一个枕头，调整体位充分暴露膝关节。采用2～5 mL浓度为2%的利多卡因麻醉，采用5号针头抽取5 mL膝关节积液，向双膝关节腔内一次性注射浓度为40 μg/mL的医用臭氧5 mL，注射完毕后进行包扎[8，9]。
1.4 检测方法
三组治疗前后采用5 mL空针抽取2 mL生理盐水，缓慢注入关节腔内，待关节腔周围组织膨胀后停止注入，反复抽吸，移到试管内待检。采用酶联免疫吸附试验测定三组治疗前后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平，相关操作步骤必须严格遵循仪器、试剂盒操作说明[10，11]。
1.5 观察指标
（1）大体观察。三组大白兔处理6周后处死，观察三组新西兰大白兔膝关节形态、光泽、滑液量等。（2）检测TNF-α、IL-1β、MMP-1水平。观察三组处理前后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平。
1.6 统计学分析
采用SPSS18.0统计学软件处理数据，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，计量资料以（x±s）表示，采用t检验及方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组大白兔处理6周后膝关节形态
观察组大白兔采用医用臭氧进行6周处理后关节软骨光泽明亮，光滑无裂纹，滑膜为白色、光泽、光滑，滑液量相对较少，无色；对照组新西兰大白兔局部软化，部分大白兔出血溃疡，滑膜充血、水肿，并且滑液量相对较多，见图1。
2.2 三组大白兔处理前后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平比较
三组大白兔处理前TNF-α、IL-1β、MMP-1水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；观察组处理后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平低于对照组和空白对照组（P<0.05），对照组处理后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平低于空白对照组（P<0.05），见表1。
3讨论
骨性关节炎是临床上常见的疾病，它是一种病因不同，但是生物学、形态学及临床表现相似的疾病，患者发病后不仅会引起关节软骨损害，还会累及整个滑膜、软骨、下骨、关节囊和关节周围肌肉，严重者最终会引起关节软骨退变、纤维化、溃疡等，甚至威胁整个关节面。文献报道表明，骨关节炎的发生与炎症、创伤、年龄及肥胖等有关。患者发病后临床表现为关节软骨退变、软骨下硬化、滑膜组织增生等。近年來，医用臭氧在骨关节炎中得到应用，且效果理想。本课题以大白兔为研究对象，采用医用臭氧进行治疗。本研究中，观察组大白兔采用医用臭氧进行6周处理后关节软骨光泽明亮，光滑无裂纹，滑膜为白色、光泽、光滑，滑液量相对较少，无色；对照组新西兰大白兔局部软化，部分大白兔出血溃疡，滑膜充血、水肿，并且滑液量相对较多。医用臭氧是氧气与臭氧根据一定的比例混合的气体，其主要有效成分为臭氧，它是氧的同素异形体，分子由动态不稳定结构的三个氧原子组成，并且化学性能极其不稳定[12-14]。同时，臭氧还是一种强氧化剂，具有较强的氧化消毒、杀菌能力，能产生活性氧和脂质过氧化物，从而发挥疾病治疗效果。国内学者[15]进行一项试验，试验中将48例OA患者随机分为臭氧治疗组与玻璃酸钠治疗组，比较患者治疗前后VAS及关节功能情况，结果显示在解除关节疼痛及关节功能改善的优良率方面，臭氧治疗组优于玻璃酸钠组（P<0.05），同时，组间患者治疗不良反应发生率比较差异无统计学意义。目前，临床上对于OA的发病机制尚不完全知晓，发病后以关节软骨降解为主，而TNF-α、IL-1β、MMP-1水平在OA的发生、发展中均发挥重要的作用，医用臭氧的运用能有效地缓解机体关节活动能力限制，从而改善机体关节滑液的氧平衡，及时清除体内的自由基，减轻氧化压力，从而缓解机体炎症，促进机体病灶关节早期恢复[15-19]。从本研究可以看出，医用臭氧的应用能降低关节滑液中TNF-α、IL-1β、MMP-1水平，快速改善机体症状，为后续治疗奠定基础。但是，对于单一采用臭氧治疗效果不理想者，则可以联合其他方法治疗，发挥不同治疗方案优势，达到优势互补，提高临床治疗效果。 综上所述，兔膝骨关节炎采用医用臭氧治疗效果理想，能降低关节滑液中TNF-α、IL-1β、MMP-1水平，为临床治疗膝骨关节炎提供依据和参考。
[参考文献]
[1] Borras-Verdera A，Calcedo-Bernal V，Ojeda-Levenfeld J，et al. Efficacy and safety of a single intra-articular injection of 2% hyaluronic acid plus mannitol in knee osteoarthritis over a 6-month period[J]. Revista Espanola de Cirugia Ortopedicay Traumatologia，2012，56（4）：274-280.
[2] 张艳锋. 膝关节镜联合透明质酸钠治疗老年膝关节骨性关节炎疗效观察[J]. 中国现代药物应用，2013，7（22）：116-117.
[3] Vincent HK，Montero C，Conrad BP，et al. "Functional pain" functional outcomes，and quality of life after hyaluronic acid intra-articular injection for knee osteoarthritis[J].PM
[关键词] 医用臭氧；兔膝骨关节炎；关节滑液；TNF-α；IL-1β；MMP-1
[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）34-0004-04
Effect of medical ozone on the levels of inflammatory factors of knee osteoarthritis in rabbits
CHEN Xiaogang LV Yi LI Guijin ZENG Yuqing
Department of Orthopedics， the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， China
[Abstract] Objective To observe the application of medical ozone in rabbit knee osteoarthritis and to investigate its effect on the levels of tumor necrosis factor （TNF-α）， interleukin （IL-1β） and matrix metalloproteinase-1（MMP-1） in synovial fluid. Methods 60 New Zealand white rabbits were collected， and the model of rabbit knee osteoarthritis was established by modified Hulth method. They were assigned to the blank control group （n=20）， the control group （n=20） and the observation group（n=20） according to the different treatment methods. The blank control group was not given any treatment method， the control group was orally given normal saline， and the observation group was treated with medical ozone. The level of TNF-α， IL-1β and MMP-1 in the three groups before and after treatment were measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. The curative effect was compared among three groups. Results The rabbits in the observation group were treated with medical ozone for 6 weeks. The articular cartilage was bright and smooth without cracks. The synovium was white， shiny， and smooth. The amount of synovial fluid was relatively small and colorless. The local part was softened in the New Zealand rabbits in the control group. Hemorrhage ulcer， synovial congestion and edema could be observed in some rabbits， and the amount of synovial fluid was relatively much； there was no statistically significant difference in the levels of TNF-α， IL-1β and MMP-1 among three groups before the treatment（P>0.05）； the levels of TNF-α， IL-1β and MMP-1 in the observation group after treatment were lower than those in the control group and the blank control group（P<0.05）. The levels of TNF-α， IL-1β and MMP-1 in the control group after the treatment were lower than those in the blank control group（P<0.05）. Conclusion The therapeutic effect of medical ozone in the treatment of knee osteoarthritis is ideal， which can decrease the levels of TNF-α， IL-1β and MMP-1 in synovial fluid. [Key words] Medical ozone； Rabbit knee osteoarthritis； Synovial fluid； TNF-α； IL-1β； MMP-1
骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是临床上常见的疾病，该疾病属于退行性骨关节病，具有较高的发病率、致残率，患者发病后如果不采取有效的方法治疗，将会诱发其他疾病，严重影响患者生活质量[1]。目前，临床上对于OA以对症支持治疗、关节镜清理、人工关节置换术为主，这些方法虽然能改善患者症状，但是长期疗效欠佳，手术治疗费用相对较高，治疗适应证较窄，难以满足每位患者治疗需要[2，3]。文献报道显示[4，5]，近年来注射疗法因其具有较好的疗效、相对减轻全身用药后对身体的副作用少及较低的费用而发展迅速，已广泛应用于临床，其中医用臭氧在OA患者中效果理想，该方法能有效改善机体症状，促进机体恢复，但是其具体机制尚不完全知晓。为探讨医用臭氧在兔膝骨关节炎中的应用及对关节滑液中肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素（IL-1β）、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）水平的影响，选取2015年1月～2016年7月校动物实验室的新西兰大白兔60只进行试验，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
取新西兰大白兔60只，根据处理方法不同分为空白对照组（n=20）、对照组（n=20）及观察组（n=20），雌雄随机，体重1.6～3.0 kg，平均（2.3±0.4）kg，所选动物由校动物实验中心提供，动物批号[（2014）120482551]。实验过程中对新西兰大白兔饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导性意见》相关规则。所有试验均通过医院动物委员会批准同意。
1.2 主要仪器和试剂
为保证试验的顺利完成，采用的主要仪器和试剂有动物手术器械一套（实验室前期自制）、-70℃超低温冰箱（实验室提供）、超净工作台（日本Olympus公司）、低速冷冻离心机（北京鼎国生物公司）、离心管、微量加样器（实验室提供）。
1.3 方法
1.3.1 模型的建立 三组均在两侧膝关节实施手术，采用改良Hulth法建立兔膝骨关节炎模型，建立模型前采用0.1 mg/kg、浓度为2%的戊巴比妥钠进行耳缘静脉麻醉，术区备皮，常规消毒后，行膝内侧纵行切口，逐层切开后充分暴露内侧副韧带，切开关节囊，将兔内侧副韧带、内侧半月板及前交叉韧带切断，建立兔膝骨关节炎模型。术后新西兰大白兔分笼饲养，不固定伤肢，每只大白兔建立模型后注射40万单位青霉素，连续注射3 d预防感染[6，7]。
1.3.2 处理方法 三组大白兔建立模型后7 d开始实施相应的方法处理。空白对照组不采取任何方法处理。对照组灌服生理盐水治疗，对大白兔每天灌服10 mL生理盐水，每天3次，连续灌服6周（1个疗程）。观察组采用医用臭氧治疗，新西兰大白兔仰卧在操作台上，膝关节下垫一个枕头，调整体位充分暴露膝关节。采用2～5 mL浓度为2%的利多卡因麻醉，采用5号针头抽取5 mL膝关节积液，向双膝关节腔内一次性注射浓度为40 μg/mL的医用臭氧5 mL，注射完毕后进行包扎[8，9]。
1.4 检测方法
三组治疗前后采用5 mL空针抽取2 mL生理盐水，缓慢注入关节腔内，待关节腔周围组织膨胀后停止注入，反复抽吸，移到试管内待检。采用酶联免疫吸附试验测定三组治疗前后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平，相关操作步骤必须严格遵循仪器、试剂盒操作说明[10，11]。
1.5 观察指标
（1）大体观察。三组大白兔处理6周后处死，观察三组新西兰大白兔膝关节形态、光泽、滑液量等。（2）检测TNF-α、IL-1β、MMP-1水平。观察三组处理前后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平。
1.6 统计学分析
采用SPSS18.0统计学软件处理数据，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，计量资料以（x±s）表示，采用t检验及方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组大白兔处理6周后膝关节形态
观察组大白兔采用医用臭氧进行6周处理后关节软骨光泽明亮，光滑无裂纹，滑膜为白色、光泽、光滑，滑液量相对较少，无色；对照组新西兰大白兔局部软化，部分大白兔出血溃疡，滑膜充血、水肿，并且滑液量相对较多，见图1。
2.2 三组大白兔处理前后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平比较
三组大白兔处理前TNF-α、IL-1β、MMP-1水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；观察组处理后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平低于对照组和空白对照组（P<0.05），对照组处理后TNF-α、IL-1β、MMP-1水平低于空白对照组（P<0.05），见表1。
3讨论
骨性关节炎是临床上常见的疾病，它是一种病因不同，但是生物学、形态学及临床表现相似的疾病，患者发病后不仅会引起关节软骨损害，还会累及整个滑膜、软骨、下骨、关节囊和关节周围肌肉，严重者最终会引起关节软骨退变、纤维化、溃疡等，甚至威胁整个关节面。文献报道表明，骨关节炎的发生与炎症、创伤、年龄及肥胖等有关。患者发病后临床表现为关节软骨退变、软骨下硬化、滑膜组织增生等。近年來，医用臭氧在骨关节炎中得到应用，且效果理想。本课题以大白兔为研究对象，采用医用臭氧进行治疗。本研究中，观察组大白兔采用医用臭氧进行6周处理后关节软骨光泽明亮，光滑无裂纹，滑膜为白色、光泽、光滑，滑液量相对较少，无色；对照组新西兰大白兔局部软化，部分大白兔出血溃疡，滑膜充血、水肿，并且滑液量相对较多。医用臭氧是氧气与臭氧根据一定的比例混合的气体，其主要有效成分为臭氧，它是氧的同素异形体，分子由动态不稳定结构的三个氧原子组成，并且化学性能极其不稳定[12-14]。同时，臭氧还是一种强氧化剂，具有较强的氧化消毒、杀菌能力，能产生活性氧和脂质过氧化物，从而发挥疾病治疗效果。国内学者[15]进行一项试验，试验中将48例OA患者随机分为臭氧治疗组与玻璃酸钠治疗组，比较患者治疗前后VAS及关节功能情况，结果显示在解除关节疼痛及关节功能改善的优良率方面，臭氧治疗组优于玻璃酸钠组（P<0.05），同时，组间患者治疗不良反应发生率比较差异无统计学意义。目前，临床上对于OA的发病机制尚不完全知晓，发病后以关节软骨降解为主，而TNF-α、IL-1β、MMP-1水平在OA的发生、发展中均发挥重要的作用，医用臭氧的运用能有效地缓解机体关节活动能力限制，从而改善机体关节滑液的氧平衡，及时清除体内的自由基，减轻氧化压力，从而缓解机体炎症，促进机体病灶关节早期恢复[15-19]。从本研究可以看出，医用臭氧的应用能降低关节滑液中TNF-α、IL-1β、MMP-1水平，快速改善机体症状，为后续治疗奠定基础。但是，对于单一采用臭氧治疗效果不理想者，则可以联合其他方法治疗，发挥不同治疗方案优势，达到优势互补，提高临床治疗效果。 综上所述，兔膝骨关节炎采用医用臭氧治疗效果理想，能降低关节滑液中TNF-α、IL-1β、MMP-1水平，为临床治疗膝骨关节炎提供依据和参考。
[参考文献]
[1] Borras-Verdera A，Calcedo-Bernal V，Ojeda-Levenfeld J，et al. Efficacy and safety of a single intra-articular injection of 2% hyaluronic acid plus mannitol in knee osteoarthritis over a 6-month period[J]. Revista Espanola de Cirugia Ortopedicay Traumatologia，2012，56（4）：274-280.
[2] 张艳锋. 膝关节镜联合透明质酸钠治疗老年膝关节骨性关节炎疗效观察[J]. 中国现代药物应用，2013，7（22）：116-117.
[3] Vincent HK，Montero C，Conrad BP，et al. "Functional pain" functional outcomes，and quality of life after hyaluronic acid intra-articular injection for knee osteoarthritis[J].PM