自交不亲和（Self-incompatibility,SI）是显花植物在长期进化过程中形成的抑制自交,促进异交,利于物种生存的重要机制。基于S-RNase（S-Ribonuclease）类型的SI在植物界中普遍存在,如蔷薇科、茄科以及玄参科,该类型SI以S-RNase为花柱S决定因子,SLF（S-locus F-box）为花粉S决定因子。柑橘是世界第一大水果,在国民经济中具有举足轻重的地位,属于芸香科柑橘亚族植物,其包含的柚类均具有自交不亲和性状,而宽皮柑橘以及其杂交种则普遍具有的自交亲和（Self-compatibility,SC）特性。但迄今为止,关于控制柑橘自交不亲和雌雄蕊决定因子仍未被克隆及鉴定。本研究通过细胞学、遗传学及离体生化实验首次克隆并鉴定到控制柑橘自交不亲和关键雌雄蕊决定因子;利用细菌人工染色体的方法获得S单体型基因组信息;此外利用柑橘基因组重测序数据系统地解析了柑橘亚族SI与SC的演化过程,以及SC与柑橘无融合生殖的关系。主要研究结果如下:1.柚类自交不亲和现象的生理特点分析为确定柚类是否具有SI现象,对不同柚类品种进行自交及杂交实验,结果表明HB柚、晚白柚、水晶蜜柚以及琯溪蜜柚在无授粉的情况下也能正常坐果,并且果实表现出无籽,证明这些柚品种除具有自交不亲和性状外还具有单性结实能力。9个柚类品种异交授粉后,大量花粉管束均可到达花柱底部,且均能产生有籽果实;而自交授粉后的花粉管在花柱顶部位置停止生长,且果实表现为无籽。此外,部分异交授粉表现出半亲和现象,即一半花粉管可到达花柱底部,一半停止生长在花柱顶部。由此说明柚类品种具有配子体型的自交不亲和。2.甜橙以及克里曼丁全基因组S-RNase分析基于甜橙与克里曼丁全基因组数据,鉴定到16个RNase T2基因。其中CgRNS₃在花柱中特异表达,具有花柱S决定因子的多个特点。利用体外花粉培养体系,证明了CgRNS₃重组蛋白可显著抑制自身花粉管生长,且热变性后的蛋白对自身以及非自身花粉管均无显著抑制。然而,CgRNS₃的等位基因在不同柚类品种中并无多态性,且与品种S基因型无共分离特征。由此推测,CgRNS₃基因并不是柑橘自交不亲和反应的花柱S决定因子。3.柑橘花柱S决定因子鉴定及功能验证利用64份柚类花柱以及花药的转录组,鉴定到9个花柱中特异性表达的S-RNase基因以及一个截短的S_m-RNase。S_m-RNase基因含有一个碱基缺失,导致翻译过程中的移码突变且提前终止。相比正常S-RNase基因来说,S_m-RNase在花柱中的表达量较低。收集394份中国柚类自然群体,基于这9个S-RNase可鉴定77%柚类的S单体型,每个S单体型的频率在2.3³0.4%。柚类F1群体证明了这些基因与柚类S单体型共分离。S₁-RNase与S₂-RNase重组蛋白可特异性地抑制携带相同S单体型花粉管的生长,并引起花粉管内部微丝骨架的重排。截短的S_m-RNase丧失花粉特异抑制活性,而修复后的S_m^R-RNase重新获得抑制活性。这些结果充分证明鉴定到的S-RNase为柑橘自交不亲和花柱S决定因子。4.柑橘S单体型以及花粉S决定因子鉴定利用细菌人工染色体的方法以及已报道的柑橘基因组数据,获得了柑橘的9个S单体型,其长度为198³70kb,位于1号染色体的靠端粒区域,共包含113个SLF/SLFL。每个S单体型上大约有8个高多态性的SLF以及3个保守的SLFL。SLF在花粉中特异表达,与S-RNase紧密连锁。系统进化树将所有SLF/SLFL分为12大类。S-RNase与同一S单体型的SLF/SLFL表现出共进化,它们均含有较高多态性,且同义与非同义替代率相当;而每个大类中等位的SLF/SLFL则分化的较晚,相互之间序列保守,同义与非同义替代率均极低。可见柑橘的S单体型含有多个SLF,其自交不亲和机制可能为非自我识别模式。5.柑橘自交亲和（SC）的演化分析基于153份柑橘重测序数据,发现90个柑橘品种含有S_m-RNase基因,且这些品种均表现出SC现象。本研究认为SI与SC之间的转变首先发生在宽皮柑橘中,而后通过基因渗入或杂交的方式,S_m-RNase被宽皮柑橘的杂交种所获得,然而柚类与枸橼类仍然保持SI性状。此外,柑橘的无融合生殖性状极大地促进柑橘SC性状的固定。本研究证明了柑橘具有S-RNase介导的配子体型的自交不亲和,柑橘作为另一新鉴定出的S-RNase类型物种,成为S-RNase类型的SI的比较进化研究中新里程碑。且柑橘与其他S-RNase类型的物种的分化至少在1.17亿年前,因此它的S-RNase系统的鉴定为该类型的SI进化提供了重要的新信息。此外,本研究证明了S_m-RNase突变导致柑橘中SI性状丢失,解析了153个柑橘品种中SI与SC的转变过程。柑橘中无融合生殖对SC性状的选择为植物生殖进化策略的改变提供了一个有趣的案例。