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【摘要】目的：优选苦豆草的酶法提取工艺，提高苦豆草生物碱的提取率。方法：以苦豆草生物碱为指标，通过单因素实验及正交试验优化酶质量浓度、pH、酶解温度、酶解时间等工艺参数。结果：最佳提取工艺条件为：酶解时间4h，缓冲液pH=6，酶用量为1mg/g，酶解温度50℃，酶法提取的提取率比传统提取法提高了37%。结论：该工艺简单、合理，适用于工业化生产。
【关键词】苦豆草；生物碱；酶法提取
【中图分类号】R284【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）06-0020-03
苦豆草系豆科槐属苦豆子（Sophora alopecuroides L）的干燥地上部分[1]。苦豆草全株味极苦、性寒、有毒，具有清热解毒、抗菌消炎的作用，民间用其根治疗喉痛、咳嗽、痢疾及湿疹等[2] 。其主要化学成分为生物碱和黄酮，且生物碱已制成苦参素、妇炎栓、克泻灵等药物[3] 。目前，苦豆草中总生物碱的提取多为超声、微波和回流提取方法[4]，其不易放大到工业生产、提取率偏低、提取时间长，而近年来生物酶被用于辅助提取中药材有效成分。选用恰当的酶，可以温和地将中药材的细胞壁破坏，达到最高提取收率[5]。酶法提取具有节约能源和时间、降低生产成本，产物稳定、纯度和活性高的优点。实验拟在酸提工艺前加一步酶解过程，使纤维素酶破坏细胞壁并将纤维素软化，促进有效成分溶出，从而提高苦豆草总生物碱的收率。
1仪器与材料
11仪器往复式切药机（山东青州精诚制药设备有限公司）；TU-1810紫外分光光度计（北京普析通用分析仪器有限公司）；DHG-9140A型电热恒温干燥箱（郑州南北仪器设备有限公司）；AE-240电子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；DKB-8A 电热恒温水槽（上海精宏仪器设备有限公司）；130-A 型高速粉碎机（长沙市中南制药机械厂）。
12材料苦豆草（采于盐池县花马池镇德胜墩自然村等地）经鉴定为豆科槐属植物苦豆子（Sophora alopecuroides L）地上部分，粉碎备用；纤维素酶（150000u/g）购于宁夏和氏璧生物有限公司，槐定碱对照品购于中国食品药品检定研究院；所用试剂均为分析纯。
2方法与结果
21苦豆草提取物含量测定苦豆草总生物碱含20多种单体，其中以槐定碱的含量最高，参考相关文献[4]采用溴麝香草酚蓝比色法以槐定碱为指标成分测定苦豆草总生物碱含量（λ=410nm）。具体方法如下。
211标准曲线的制作精密称定槐定碱对照品5mg，置5mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得槐定碱对照液。取上述溶液0、20、40、60、80、100、120、140μL，分别置于50mL的磨口锥形瓶中，挥尽乙醇，加溴麝香草酚蓝pH=76缓冲液12mL、氯仿12mL，密塞剧烈振摇2min，静置2h后分出氯仿层，以第一个为空白，于410nm处测定提取液的吸光度，以吸光度为纵坐标，氯仿层浓度为横坐标得回归方程（A=00133C-00134，R=09996，线性范围为1667 ～ 11667μg/mL）。
212样品含量测定分别吸取传统酸提法或者酶提取法的滤液1mL，稀释至100mL，吸取02mL至锥形瓶中，加入溴麝香草酚蓝pH=76缓冲液12mL，氯仿12mL，密塞振摇2min，加入50mL锥形瓶中，静置2h，分取氯仿层，以对应的提取溶剂1mL，溴麝香草酚蓝pH=76缓冲液12mL和氯仿12mL同比操作为空白，于410nm处测定提取液的吸光度A，利用标准曲线计算苦豆草总生物碱的含量[4]。
22苦豆草总生物碱的提取
221传统酸提法取苦豆草干燥药材细粉约10g，精密称定，加入04%盐酸300mL，回流提取4h，滤过，收集滤液按212方法进行含量测定。
222酶提取法取苦豆草干燥药材细粉约10g，精密称定，加入磷酸-磷酸钠缓冲溶液（pH=5），再加入纤维素酶（1∶[KG-*3/5]500），恒温水浴反应4h后，加入盐酸至溶液成04%盐酸，按“221”项下方法提取后过滤，收集滤液按“212”项下方法进行含量测定。
23纤维素酶辅助提取工艺条件优化
231酶质量浓度的影响在50℃、pH值为50、酶解4h，酶用量分别为2、1、04、02、01 mg/g条件下按“222”项下酶提法进行提取苦豆草，过滤后收集滤液测含量考察酶用量对苦豆草总生物碱提取率的影响。结果显示，随着酶用量的增加生物碱提取率逐渐增加，酶用量为2mg/g时提取率最高。由于酶用量1mg/g和2mg/g对生物碱提取率的影响不大，考虑成本问题，故选择1mg/g。见图1。
232pH值的影响纤维素酶的质量浓度为1mg/g，在50℃、pH值在4、45、5、55、6 条件下酶解4h，酶解后04%盐酸提取考察pH值对提取率的影响。结果显示，纤维素酶在pH=55時提取效果最好。见图2。
[JP2]233酶解温度的影响在纤维素酶的质量浓度为1mg/g，pH 值55，35、40、45、50、55℃不同温度下酶解4h，酶解后04%盐酸回流提取。当酶解温度为50℃时，苦豆草生物碱提取率最高。见图3。[JP]
234酶解时间的影响使纤维素酶的质量浓度为1mg/g，在50℃，pH值为55时，酶解1、2、3、4、5h，然后04%盐酸加热回流提取。随着酶解时间的延长，提取率不断增加，酶解5h时提取率最高。见图4。
24正交设计及优化以酶解时间（A）、pH值（B）、酶用量（C）和酶解温度（D）为因素，通过预实验确定每个因素的3个水平，按表L9（34）设计正交实验，以2次平行操作所得苦豆草生物碱的平均得率为评价指标。因素水平见表1，正交实验结果见表2。试验结果表明，四个因素对提取率的影响主次顺序为A > B > C >D。并得出最佳的提取工艺条件是：A2B3C2D3，即酶解时间4h，缓冲液pH=6，酶用量为1mg/g，酶解温度50℃。 3讨论
中药中根茎皮类药材的细胞壁中纤维素含量较高，植物的有效成分一般都包裹在细胞壁内，纤维素酶可破坏纤维素的结构，从而使有效成分从植物细胞壁中溶出，提高了有效成分的提取效率[6]。本工艺首先运用纤维素酶将药材细胞壁中的纤维素降解，降低了生物碱从植物细胞中溶出的传质阻力；其次，提取溶剂中加入盐酸除灭活酶外还与生物碱成盐，进一步促进了生物碱的溶出[7]。通过正交试验找出了酶辅助提取工艺的最优条件，其苦豆草生物碱的提取率为224%，未经酶解的酸回流提取为163%，酶法提取率提高了37%，可见酶解处理有助于苦豆草生物碱的溶出。因此，纤维素酶可以降解并破坏植物显微组织，促进生物碱的溶出，从而提高了收率[8]。同时酶法提取只是在原有工艺基础上增加酶解过程，而不必对原有工艺进行大的改变，而且操作简便易行，不需另外添加生产设备，适用于工业化生产。
参考文献
[1]陈海燕， 郭鸿雁， 冷晓红. HPLC法测定西北地区不同产地苦豆子药材中生物碱的含量[J]. 北方药学， 2013， 10（5）： 10-11.
[2]廖春燕，梁健，杨燕，等. 苦豆子的药理及应用概述[J]. 中国民族民间医药， 2009， 5： 6-8.
[3]邢世瑞. 宁夏中药志[M]. 2版.银川： 宁夏人民出版社， 2006：669-705.
[4]李军， 郝彩琴， 陈海燕，等. 酶法提取苦豆草生物碱研究[J]. 西北药学杂志， 2014， 29（4）： 347-350.
[5]鄧志勇. 纤维素酶法提取叶下珠总生物碱的工艺研究[J]. 食品工业， 2013， 34 （3）：159-161.
[6]陈晓琳， 张岩柏， 邓振雪， 等. 酶法提取白英中总生物碱的工艺研究[J]. 西北药学杂志， 2012， 27（4）：291-293.
[7]陆世惠，李秀霞. 超声-酶法提取两面针中氯化两面针碱的研究[J]. 中成药， 2013， 35（4）： 841-844.
[8]周蓉，王洛临，徐文杰，等. 菟丝子的酶法提取工艺优选[J]. 中国实验方剂学杂志， 2014， 20（22）：33-36.
（收稿日期：2017-01-10编辑：穆丽华）
【关键词】苦豆草；生物碱；酶法提取
【中图分类号】R284【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）06-0020-03
苦豆草系豆科槐属苦豆子（Sophora alopecuroides L）的干燥地上部分[1]。苦豆草全株味极苦、性寒、有毒，具有清热解毒、抗菌消炎的作用，民间用其根治疗喉痛、咳嗽、痢疾及湿疹等[2] 。其主要化学成分为生物碱和黄酮，且生物碱已制成苦参素、妇炎栓、克泻灵等药物[3] 。目前，苦豆草中总生物碱的提取多为超声、微波和回流提取方法[4]，其不易放大到工业生产、提取率偏低、提取时间长，而近年来生物酶被用于辅助提取中药材有效成分。选用恰当的酶，可以温和地将中药材的细胞壁破坏，达到最高提取收率[5]。酶法提取具有节约能源和时间、降低生产成本，产物稳定、纯度和活性高的优点。实验拟在酸提工艺前加一步酶解过程，使纤维素酶破坏细胞壁并将纤维素软化，促进有效成分溶出，从而提高苦豆草总生物碱的收率。
1仪器与材料
11仪器往复式切药机（山东青州精诚制药设备有限公司）；TU-1810紫外分光光度计（北京普析通用分析仪器有限公司）；DHG-9140A型电热恒温干燥箱（郑州南北仪器设备有限公司）；AE-240电子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；DKB-8A 电热恒温水槽（上海精宏仪器设备有限公司）；130-A 型高速粉碎机（长沙市中南制药机械厂）。
12材料苦豆草（采于盐池县花马池镇德胜墩自然村等地）经鉴定为豆科槐属植物苦豆子（Sophora alopecuroides L）地上部分，粉碎备用；纤维素酶（150000u/g）购于宁夏和氏璧生物有限公司，槐定碱对照品购于中国食品药品检定研究院；所用试剂均为分析纯。
2方法与结果
21苦豆草提取物含量测定苦豆草总生物碱含20多种单体，其中以槐定碱的含量最高，参考相关文献[4]采用溴麝香草酚蓝比色法以槐定碱为指标成分测定苦豆草总生物碱含量（λ=410nm）。具体方法如下。
211标准曲线的制作精密称定槐定碱对照品5mg，置5mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得槐定碱对照液。取上述溶液0、20、40、60、80、100、120、140μL，分别置于50mL的磨口锥形瓶中，挥尽乙醇，加溴麝香草酚蓝pH=76缓冲液12mL、氯仿12mL，密塞剧烈振摇2min，静置2h后分出氯仿层，以第一个为空白，于410nm处测定提取液的吸光度，以吸光度为纵坐标，氯仿层浓度为横坐标得回归方程（A=00133C-00134，R=09996，线性范围为1667 ～ 11667μg/mL）。
212样品含量测定分别吸取传统酸提法或者酶提取法的滤液1mL，稀释至100mL，吸取02mL至锥形瓶中，加入溴麝香草酚蓝pH=76缓冲液12mL，氯仿12mL，密塞振摇2min，加入50mL锥形瓶中，静置2h，分取氯仿层，以对应的提取溶剂1mL，溴麝香草酚蓝pH=76缓冲液12mL和氯仿12mL同比操作为空白，于410nm处测定提取液的吸光度A，利用标准曲线计算苦豆草总生物碱的含量[4]。
22苦豆草总生物碱的提取
221传统酸提法取苦豆草干燥药材细粉约10g，精密称定，加入04%盐酸300mL，回流提取4h，滤过，收集滤液按212方法进行含量测定。
222酶提取法取苦豆草干燥药材细粉约10g，精密称定，加入磷酸-磷酸钠缓冲溶液（pH=5），再加入纤维素酶（1∶[KG-*3/5]500），恒温水浴反应4h后，加入盐酸至溶液成04%盐酸，按“221”项下方法提取后过滤，收集滤液按“212”项下方法进行含量测定。
23纤维素酶辅助提取工艺条件优化
231酶质量浓度的影响在50℃、pH值为50、酶解4h，酶用量分别为2、1、04、02、01 mg/g条件下按“222”项下酶提法进行提取苦豆草，过滤后收集滤液测含量考察酶用量对苦豆草总生物碱提取率的影响。结果显示，随着酶用量的增加生物碱提取率逐渐增加，酶用量为2mg/g时提取率最高。由于酶用量1mg/g和2mg/g对生物碱提取率的影响不大，考虑成本问题，故选择1mg/g。见图1。
232pH值的影响纤维素酶的质量浓度为1mg/g，在50℃、pH值在4、45、5、55、6 条件下酶解4h，酶解后04%盐酸提取考察pH值对提取率的影响。结果显示，纤维素酶在pH=55時提取效果最好。见图2。
[JP2]233酶解温度的影响在纤维素酶的质量浓度为1mg/g，pH 值55，35、40、45、50、55℃不同温度下酶解4h，酶解后04%盐酸回流提取。当酶解温度为50℃时，苦豆草生物碱提取率最高。见图3。[JP]
234酶解时间的影响使纤维素酶的质量浓度为1mg/g，在50℃，pH值为55时，酶解1、2、3、4、5h，然后04%盐酸加热回流提取。随着酶解时间的延长，提取率不断增加，酶解5h时提取率最高。见图4。
24正交设计及优化以酶解时间（A）、pH值（B）、酶用量（C）和酶解温度（D）为因素，通过预实验确定每个因素的3个水平，按表L9（34）设计正交实验，以2次平行操作所得苦豆草生物碱的平均得率为评价指标。因素水平见表1，正交实验结果见表2。试验结果表明，四个因素对提取率的影响主次顺序为A > B > C >D。并得出最佳的提取工艺条件是：A2B3C2D3，即酶解时间4h，缓冲液pH=6，酶用量为1mg/g，酶解温度50℃。 3讨论
中药中根茎皮类药材的细胞壁中纤维素含量较高，植物的有效成分一般都包裹在细胞壁内，纤维素酶可破坏纤维素的结构，从而使有效成分从植物细胞壁中溶出，提高了有效成分的提取效率[6]。本工艺首先运用纤维素酶将药材细胞壁中的纤维素降解，降低了生物碱从植物细胞中溶出的传质阻力；其次，提取溶剂中加入盐酸除灭活酶外还与生物碱成盐，进一步促进了生物碱的溶出[7]。通过正交试验找出了酶辅助提取工艺的最优条件，其苦豆草生物碱的提取率为224%，未经酶解的酸回流提取为163%，酶法提取率提高了37%，可见酶解处理有助于苦豆草生物碱的溶出。因此，纤维素酶可以降解并破坏植物显微组织，促进生物碱的溶出，从而提高了收率[8]。同时酶法提取只是在原有工艺基础上增加酶解过程，而不必对原有工艺进行大的改变，而且操作简便易行，不需另外添加生产设备，适用于工业化生产。
参考文献
[1]陈海燕， 郭鸿雁， 冷晓红. HPLC法测定西北地区不同产地苦豆子药材中生物碱的含量[J]. 北方药学， 2013， 10（5）： 10-11.
[2]廖春燕，梁健，杨燕，等. 苦豆子的药理及应用概述[J]. 中国民族民间医药， 2009， 5： 6-8.
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[4]李军， 郝彩琴， 陈海燕，等. 酶法提取苦豆草生物碱研究[J]. 西北药学杂志， 2014， 29（4）： 347-350.
[5]鄧志勇. 纤维素酶法提取叶下珠总生物碱的工艺研究[J]. 食品工业， 2013， 34 （3）：159-161.
[6]陈晓琳， 张岩柏， 邓振雪， 等. 酶法提取白英中总生物碱的工艺研究[J]. 西北药学杂志， 2012， 27（4）：291-293.
[7]陆世惠，李秀霞. 超声-酶法提取两面针中氯化两面针碱的研究[J]. 中成药， 2013， 35（4）： 841-844.
[8]周蓉，王洛临，徐文杰，等. 菟丝子的酶法提取工艺优选[J]. 中国实验方剂学杂志， 2014， 20（22）：33-36.
（收稿日期：2017-01-10编辑：穆丽华）