目的建立一种能够检测MDCK细胞基质流感疫苗中宿主细胞蛋白（host cell protein, HCP）含量的双抗体夹心ELISA并进行验证。方法通过培养MDCK细胞获取工艺特异性的MDCK HCP,进一步处理获得参考品。将MDCK HCP分别免疫新西兰兔和波尔山羊获得抗HCP的多克隆抗体。抗体经纯化后进行SDS-PAGE分析,间接ELISA分析鉴定抗体效价并验证特异性,选择效价较高的兔抗体作为包被抗体,使用HRP标记羊抗体获得显示抗体,从而建立检测MDCK HCP的双抗体夹心ELISA。确定该方法所用抗体的工作浓度以及线性范围,验证准确性、重复性、中间精密度、耐用性和特异性。然后,使用该方法对生产过程中的样品进行检定,并将检测结果与商品试剂盒的检测结果进行比对。结果制备的HCP参考品相对分子质量分布在25 000～80 000之间,抗原质量浓度为31.74μg/mL。免疫新西兰兔和波尔山羊获得高质量抗体,抗体效价分别为1∶512 000、1∶128 000,纯化后的多抗特异性良好。选择抗体效价较高的兔抗体作为包被抗体,工作浓度较高的酶标羊抗作为显示抗体建立双抗体夹心ELISA。方阵滴定法确定了包被抗体工作质量浓度为4μg/mL,显示抗体的工作浓度为1∶3 200,该方法在20～400 ng/mL范围内线性关系良好（R~2＞0.99）,不同浓度的MDCK HCP回收率在95.62%～113.82%之间,CV＜10%,重复性和中间精密度结果的CV＜10%,显示抗体孵育时间在0.5～1.5 h内对实验无影响,显色时间在10～20 min内对实验无影响,特异性良好。使用该方法对生产样品进行检测,与商用试剂盒的检测结果差异无统计学意义（P=0.236,P＞0.05）。结论建立了能检测MDCK细胞基质流感疫苗中残留HCP的双抗体夹心ELISA,方法学验证结果良好,可用于MDCK细胞基质流感疫苗生产中残留HCP的检定,对疫苗生产质量控制具有重要意义。