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【摘 要】 目的:探索玉女煎多糖提取的最佳方法。方法:采用苯酚-硫酸显色测定玉女煎多糖的含量,采用L9(34)正交试验考察提取溶剂用量、提取时间和提取次数对玉女煎多糖提取的影响,并确定多糖最佳提取工艺。结果:玉女煎最佳提取工艺为12倍量的蒸馏水回流提取3次,每次30min。结论:该工艺稳定可行,可用于玉女煎多糖的提取。
【关键词】 玉女煎;多糖;正交试验;苯酚-硫酸法
【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2015)22-0017-02
玉女煎首载于《景岳全书》[1]:“生石膏三、五钱,熟地三、五钱或一两,麦冬二钱,知母、牛膝各钱半,水一锺半,煎七分,温服或冷服”,用于“治水亏火盛,六脉浮洪滑大,少阴不足,阳明有余,烦热干渴,头痛,牙疼,失血等症”。玉女煎为滋阴润燥的代表方之一,临床常以其为基本方加减治疗糖尿病及并发症[2-7],并取得良好效果。药理研究[8-10]证实,玉女煎及其加减对多种糖尿病动物模型有降血糖的作用、方中熟地[11-12]、麦冬[13-16]、知母[17-18]和牛膝[19-23]药材均含多糖类成分,且具有降血糖作用。实验采用正交实验设计优选了玉女煎多糖提取工艺,并采用硫酸-苯酚比色法测定其含量,以期为玉女煎多糖降血糖作用进一步研究提供依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 岛津1750紫外分光光度计(日本岛津公司);HH-2K4型恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司);UP HW-IV-90T纯水机(四川优普超纯科技有限公司);Ohaus Discovery十万分之一电子分析天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)。
1.2 材料 熟地黄、石膏、麦冬、知母、牛膝均购于南充市便民大药房,经川北医学院附属医院李毅主任药师鉴定,均符合2010年版中国药典标准;水为蒸馏水,其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 标准溶液的制备 取干燥至恒重的葡萄糖对照品适量,精密称定,加蒸馏水配制成浓度为0.2mg/ml的葡萄糖对照品储备溶液,4℃保存备用。
2.1.2 供试品溶液的制备 取玉女煎(按石膏∶地黄∶麦冬∶知母∶牛膝比例为15∶30∶6∶5∶5组方)约1g,精密称定,置于圆底烧瓶中,精密加入12ml蒸馏水,称定重量,回流提取3次,每次30min,放冷,再称定重量,用蒸馏水补足减失的重量,摇匀,滤过,合并三次滤液,即得。
2.2 标准曲线的绘制 分别精密吸取葡萄糖对照品储备溶液0.5、1、1.5、2、2.5ml置10 ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀。精密量取上述各溶液2ml,加入1ml 6%的苯酚溶液,再加入5ml硫酸,90℃显色40min,取出,流水快速冷却至室温。以蒸馏水2ml按上述条件处理的溶液作为空白,在490nm处测定吸光度,以吸光度(A)为纵坐标,浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线,计算得回归方程:A=11.671C+0.0665(R=0.9993)。结果表明,葡萄糖浓度在10~50μg/ml范围内的线性关系良好。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验 取玉女煎约1g,精密称定,按“2.1”制备供试品溶液,按“2.2”项下方法测定吸光度值,重复测定6次,吸光度值RSD为0.82%,表明儀器精密度良好。
2.3.2 重复性试验 取玉女煎6份,每份约1g,精密称定,按“2.1”制备供试品溶液,按“2.2”项下方法测定吸光度值,吸光度值RSD为4.15%,表明方法的重复性良好。
2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液按“2.1”项下方法显色后,分别在0、15、30、45、60 min 5个时间点测定吸光度,吸光度值的RSD为2.64%,表明样品在1h内稳定。
2.3.4 加样回收率试验 取玉女煎5份,每份约0.5g,精密称定,每份加入20mg葡萄糖,按“2.1”制备供试品溶液,按“2.1”项下方法测定吸光度值,计算回收率。结果表明葡萄糖的平均回收率为97.62%,RSD为3.98%。
2.4 正交试验 以多糖为指标,选用L9(34)正交表对提取次数(A)、提取时间(B)和提取溶剂用量(C)3个主要因素进行考察,每个因素拟设3个水平,见表1。按正交实验表1条件对玉女煎中多糖类成分进行提取,按“2.2”项下方法测定吸光度值,并计算其含量。由表2、3可知,影响玉女煎中多糖提取效果的因素大小顺序为A>C>B,即提取次数>溶剂用量>提取时间,提取次数对试验结果有极显著性影响(P<0.01),溶剂用量对试验结果有显著性影响(P<0.05)。结合直观分析,最佳提取方法为A3B1C3:即以12倍量的蒸馏水回流提取3次,每次30min。
2.5 验证试验 取玉女煎3份,每份约1g,精密称定,置于圆底烧瓶中,用确定的最佳提取条件进行提取,按“2.2”项下方法显色测定吸光度值,并计算多糖的含量,多糖的含量分别为101.228、98.572和104.403mg/g(平均含量为101.068mg/g),RSD为3.38%,表明该工艺稳定可行。
3 讨论
苯酚-硫酸法是测定多糖含量的常用方法之一[24],其原理为多糖在浓硫酸作用下水解成单糖分子,并迅速脱水生成糠醛衍生物而与苯酚缩合生成有色化合物,该有色物具有紫外吸收且生成量与多糖浓度存在定量关系,故可用分光光度法在适当波长处测定吸光度,进而计算得到多糖含量。影响苯酚-硫酸法显色的因素较多[25],前期采用单因素考察的方法对苯酚-硫酸法中显色的影响因素:6%苯酚用量(0.5、1、1.5ml)、硫酸用量(4、5、6ml)、显色温度(50、70、90、100℃)、显色时间(30、40、50min)进行了考察,结果表明6%苯酚1ml、硫酸5ml、温度90℃、水解时间40min显色最佳。 研究通过正交实验设计对玉女煎多糖提取工艺进行了优化,根据直观分析和方差分析可知,提取次数和提取溶剂用量对玉女煎多糖提取效果的影响最大,提取时间对多糖提取效果影响较小,从而确定玉女煎多糖最佳的提取工艺条件是12倍量的蒸馏水回流提取3次,每次30min。该工艺稳定可行,可用于玉女煎多糖的提取。
参考文献
[1] 明·张介宾.景岳全书[M]. 北京: 人民卫生出版社,1991:1267.
[2]范金茹.王行宽教授从心肝论治消渴病的经验[J].湖南中医学院学报,1998,18(4):24.
[3]潘俊伟.玉女煎加减治疗非胰岛素依赖型糖尿病68例[J].中医药信息,1999,(5):24.
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[5]秦姝,李小娟.李小娟教授应用玉女煎治疗消渴病验案2则[J].辽宁中医药大学学报,2010,12(4):147-148.
[6]李靖.玉女煎加减治疗糖尿病性周围神经病变50例[J].四川中医,2002,20(10):47.
[7]王李民.玉女煎加味治疗糖尿病皮肤瘙痒症102例[J].新中医,2009,41(11):88.
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[10]張鸣,孙必强.玉女煎加减方对高血糖大鼠的实验研究[J].中国实验方剂学杂志,2008,14(7):54-56.
[11]符德学,侯艳.熟地黄、枸杞子和甜叶菊降糖作用的研究进展[J].焦作大学学报,2014,(2):83-86.
[12]吴金环,顾红岩,喇孝瑾,等.地黄与熟地黄对糖尿病小鼠血糖血脂的影响[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(8):161-163.
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[14]黄琦,许家鸾.麦冬多糖对2型糖尿病血糖及胰岛素抵抗的影响[J].浙江中西医结合杂志,2002,12(2):81-82.
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[19]奕海艳,高艳华,赵晓莲,等.牛膝多糖对糖尿病肾脏保护作用的研究[J].黑龙江医药科学,2008,31(1):56-57.
[20]李海泉.牛膝多糖降糖作用实验研究[J].安徽医药,2004,8(5):326-327.
[21]薛胜霞,金丽琴,贾东明,等.牛膝多糖衍生物对糖尿病大鼠血糖及血脂的影响[J].中国药学杂志,2009,44(2):107-110.
[22]杨旭东,张杰,申梅淑.牛膝多糖对2型糖尿病大鼠脂肪分化相关蛋白表达的影响[J].药物生物技术,2010,17(4):334-336.
[23]李金贵,袁楷,刘学忠,等.牛膝多糖对链佐星诱导性糖尿病小鼠的保护作用[J].中国药理学与毒理学杂志,2010,24(1):1-7.
[24]徐晓飞,陈健.多糖含量测定的研究进展[J].食品科学,2009,30(21):443-448.
[25]徐晶,姜瑞平,夏光辉,等.苯酚-硫酸法测定金顶侧耳中多糖含量[J].安徽农业科学,2011,39(5):2649-2651.
(收稿日期:2015.08.10)
【关键词】 玉女煎;多糖;正交试验;苯酚-硫酸法
【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2015)22-0017-02
玉女煎首载于《景岳全书》[1]:“生石膏三、五钱,熟地三、五钱或一两,麦冬二钱,知母、牛膝各钱半,水一锺半,煎七分,温服或冷服”,用于“治水亏火盛,六脉浮洪滑大,少阴不足,阳明有余,烦热干渴,头痛,牙疼,失血等症”。玉女煎为滋阴润燥的代表方之一,临床常以其为基本方加减治疗糖尿病及并发症[2-7],并取得良好效果。药理研究[8-10]证实,玉女煎及其加减对多种糖尿病动物模型有降血糖的作用、方中熟地[11-12]、麦冬[13-16]、知母[17-18]和牛膝[19-23]药材均含多糖类成分,且具有降血糖作用。实验采用正交实验设计优选了玉女煎多糖提取工艺,并采用硫酸-苯酚比色法测定其含量,以期为玉女煎多糖降血糖作用进一步研究提供依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 岛津1750紫外分光光度计(日本岛津公司);HH-2K4型恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司);UP HW-IV-90T纯水机(四川优普超纯科技有限公司);Ohaus Discovery十万分之一电子分析天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)。
1.2 材料 熟地黄、石膏、麦冬、知母、牛膝均购于南充市便民大药房,经川北医学院附属医院李毅主任药师鉴定,均符合2010年版中国药典标准;水为蒸馏水,其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 标准溶液的制备 取干燥至恒重的葡萄糖对照品适量,精密称定,加蒸馏水配制成浓度为0.2mg/ml的葡萄糖对照品储备溶液,4℃保存备用。
2.1.2 供试品溶液的制备 取玉女煎(按石膏∶地黄∶麦冬∶知母∶牛膝比例为15∶30∶6∶5∶5组方)约1g,精密称定,置于圆底烧瓶中,精密加入12ml蒸馏水,称定重量,回流提取3次,每次30min,放冷,再称定重量,用蒸馏水补足减失的重量,摇匀,滤过,合并三次滤液,即得。
2.2 标准曲线的绘制 分别精密吸取葡萄糖对照品储备溶液0.5、1、1.5、2、2.5ml置10 ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀。精密量取上述各溶液2ml,加入1ml 6%的苯酚溶液,再加入5ml硫酸,90℃显色40min,取出,流水快速冷却至室温。以蒸馏水2ml按上述条件处理的溶液作为空白,在490nm处测定吸光度,以吸光度(A)为纵坐标,浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线,计算得回归方程:A=11.671C+0.0665(R=0.9993)。结果表明,葡萄糖浓度在10~50μg/ml范围内的线性关系良好。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验 取玉女煎约1g,精密称定,按“2.1”制备供试品溶液,按“2.2”项下方法测定吸光度值,重复测定6次,吸光度值RSD为0.82%,表明儀器精密度良好。
2.3.2 重复性试验 取玉女煎6份,每份约1g,精密称定,按“2.1”制备供试品溶液,按“2.2”项下方法测定吸光度值,吸光度值RSD为4.15%,表明方法的重复性良好。
2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液按“2.1”项下方法显色后,分别在0、15、30、45、60 min 5个时间点测定吸光度,吸光度值的RSD为2.64%,表明样品在1h内稳定。
2.3.4 加样回收率试验 取玉女煎5份,每份约0.5g,精密称定,每份加入20mg葡萄糖,按“2.1”制备供试品溶液,按“2.1”项下方法测定吸光度值,计算回收率。结果表明葡萄糖的平均回收率为97.62%,RSD为3.98%。
2.4 正交试验 以多糖为指标,选用L9(34)正交表对提取次数(A)、提取时间(B)和提取溶剂用量(C)3个主要因素进行考察,每个因素拟设3个水平,见表1。按正交实验表1条件对玉女煎中多糖类成分进行提取,按“2.2”项下方法测定吸光度值,并计算其含量。由表2、3可知,影响玉女煎中多糖提取效果的因素大小顺序为A>C>B,即提取次数>溶剂用量>提取时间,提取次数对试验结果有极显著性影响(P<0.01),溶剂用量对试验结果有显著性影响(P<0.05)。结合直观分析,最佳提取方法为A3B1C3:即以12倍量的蒸馏水回流提取3次,每次30min。
2.5 验证试验 取玉女煎3份,每份约1g,精密称定,置于圆底烧瓶中,用确定的最佳提取条件进行提取,按“2.2”项下方法显色测定吸光度值,并计算多糖的含量,多糖的含量分别为101.228、98.572和104.403mg/g(平均含量为101.068mg/g),RSD为3.38%,表明该工艺稳定可行。
3 讨论
苯酚-硫酸法是测定多糖含量的常用方法之一[24],其原理为多糖在浓硫酸作用下水解成单糖分子,并迅速脱水生成糠醛衍生物而与苯酚缩合生成有色化合物,该有色物具有紫外吸收且生成量与多糖浓度存在定量关系,故可用分光光度法在适当波长处测定吸光度,进而计算得到多糖含量。影响苯酚-硫酸法显色的因素较多[25],前期采用单因素考察的方法对苯酚-硫酸法中显色的影响因素:6%苯酚用量(0.5、1、1.5ml)、硫酸用量(4、5、6ml)、显色温度(50、70、90、100℃)、显色时间(30、40、50min)进行了考察,结果表明6%苯酚1ml、硫酸5ml、温度90℃、水解时间40min显色最佳。 研究通过正交实验设计对玉女煎多糖提取工艺进行了优化,根据直观分析和方差分析可知,提取次数和提取溶剂用量对玉女煎多糖提取效果的影响最大,提取时间对多糖提取效果影响较小,从而确定玉女煎多糖最佳的提取工艺条件是12倍量的蒸馏水回流提取3次,每次30min。该工艺稳定可行,可用于玉女煎多糖的提取。
参考文献
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[13]何陵湘.麦冬多糖降血糖作用的药效学观察[J].中国实用医药,2007,2(16):48-50.
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[18]黄彩云,谢世荣,黄胜英.知母多糖对家兔血糖的影响[J].大连大学学报,2004,25(4):98-99.
[19]奕海艳,高艳华,赵晓莲,等.牛膝多糖对糖尿病肾脏保护作用的研究[J].黑龙江医药科学,2008,31(1):56-57.
[20]李海泉.牛膝多糖降糖作用实验研究[J].安徽医药,2004,8(5):326-327.
[21]薛胜霞,金丽琴,贾东明,等.牛膝多糖衍生物对糖尿病大鼠血糖及血脂的影响[J].中国药学杂志,2009,44(2):107-110.
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(收稿日期:2015.08.10)