【摘 要】
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目的构建DC-SIGN分子真核表达载体,获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系。方法以pUNO-hDC-SIGN1Aa质粒为模板,通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因,经过NotI和BamHI双酶切之后,
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目的构建DC-SIGN分子真核表达载体,获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系。方法以pUNO-hDC-SIGN1Aa质粒为模板,通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因,经过NotI和BamHI双酶切之后,将其克隆入真核表达载体pIRES-neo,构建真核表达载体pIRES-neo-DC-SIGN,以NotI和BamHI双酶切以及测序验证重组质粒的正确性。将重组质粒以Lipo-fectamineTM2000转染到BHK21细胞,通过G418及有限稀释法进行阳性克隆的筛选,建立稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,利用流式细胞仪、Western blotting及免疫荧光法检测DC-SIGN分子的表达。结果双酶切鉴定证明DC-SIGN基因已经成功克隆入真核表达载体pIRES-neo中,测序结果表明DC-SIGN基因与原序列一致。pIRES-neo-DC-SIGN转染BHK21细胞后,获得了稳定表达DC-SIGN分子的细胞系。流式细胞仪检测结果显示,阳性克隆中DC-SIGN分子的表达率为85.42%。免疫荧光结果显示,DC-SIGN分子主要表达于细胞膜表面。Western blotting能检测到DC-SIGN蛋白表达的特异条带。结论成功构建了稳定、高效表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。
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