【摘 要】
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通过构建2种真核表达载体比较Piwi蛋白在真核细胞中的表达部位,为进一步研究Piwi蛋白的生物学功能提供依据。采用RT-PCR方法克隆了狼山鸡睾丸组织中Piwi基因CDS,构建含有增强
【基金项目】
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国家自然科学基金项目(31172199;30972088);江苏省自然科学基金(BK2009190);江苏高校优势学科建设工程资助项目
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通过构建2种真核表达载体比较Piwi蛋白在真核细胞中的表达部位,为进一步研究Piwi蛋白的生物学功能提供依据。采用RT-PCR方法克隆了狼山鸡睾丸组织中Piwi基因CDS,构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-Piwi,脂质体PEI介导基因转染NIH-3T3细胞,同时构建pcDNA3.1-Piwi真核表达载体,采用细胞间接免疫荧光方法检测Piwi蛋白在NIH-3T3细胞的表达部位。结果表明,成功克隆出公鸡Piwi基因的全序列CDS,大小为2 604bp,与GenBank中预计的序列基本一致;融合表达载体pEGFP-C1-Piwi在整个细胞中都有表达;而间接免疫荧光方法检测到pcDNA3.1-Piwi载体主要在NIH-3T3细胞质中表达。Piwi蛋白主要在细胞质中表达,采用间接免疫荧光方法比EGFP报告基因法更为可靠,适合目的蛋白的亚细胞定位研究。
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