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摘要：以活性蛋白cZ处理NC89烟12 h后，摩擦接种TMV，1、5、8、12、16 d分别取各处理叶片测过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性及丙二醛(MDA)和叶绿素的含量。结果表明，POD和PAL2种酶的活性均比对照明显提高；Cz处理使NC89烟叶片内MDA的含量降低，而叶绿素的含量增高。电镜下观察到活性蛋白能打破TMV粒体的规则排列，与TMV粒体不可逆的结合，从而降低侵染力。
关键词：烟草；烟草花叶病毒；活性氧防御酶系统；活性蛋白
中图分类号：S 435，72，S 476，8
Verma等发现Clerodendrum aculeatum的叶片提取液可以系统诱导植物产生抗性；其机制是提取液中的一种碱性蛋白可以诱导寄主产生一种抗病毒的蛋白阻止病毒的侵入。近年来，有关植物的抗性与活性氧代谢的关系备受人们的关注。细菌蛋白CZ是本实验室人员在烟草种子周围细菌发酵产物中提纯得到的一种抗病毒蛋白。研究表明，CZ对烟草花叶病毒病有明显的控制作用，兼具保护作用，防效在54.74％～85.67％。电镜下观察到活性蛋白能打破TMV粒体的规则排列，与TMV粒子不可逆的结合，从而降低侵染力。本试验以NC89、TMV为材料，从植物叶绿素含量及其防御酶系统变化的角度探讨CZ的防病机理，为其应用提供可靠的理论依据。
1、材料与方法
1.1材料
普通烟NC89；TMV毒源保存在普通烟NC89烟上，细菌蛋白CZ由本实验室提纯制备，使用浓度为1.0614/μg/μL。
1.2处理植株
NC89在防虫温室中培养(20～27℃)，选择5～6叶期，长势一致、健壮的烟株供试。试验设预防处理1和2，先用脱脂棉蘸取药剂涂叶片施药12 h后接种，另设对照只接种不施药为处理3，药剂为有一定浓度的活性蛋白CZ和3％超微蛋白微粒剂(康壮素，美国伊甸生物技术公司产品)，供试药剂，共3个处理，每处理10株，重复3次，处理方法具体见表1。处理后1、5、8、12、16 d分别取各处理同一生育期、同一层次、同一叶位的叶片进行POD活性、PAL活性、MDA含量及叶绿素含量的测定。
1.3接种方法
采用常规汁液摩擦接种法接种，取病叶加去离子水研磨，(病汁液浓度为1 g病叶加80 mL水)，接种。
1.4酶活性及MDA、叶绿素含量测定
MDA含量采用张志良等的方法测定；叶绿素含量的测定采用张宪政等丙酮乙醇混合法；POD活性的测定采用愈创木酚法；PAL活性的测定按薛应龙等的方法提取和测定。
1.5电镜观察活性蛋白CZ对TMV粒体的影响
1.5.1烟草花叶病毒的提纯
TMV活体毒源NC89叶片100 g，研磨，离心去植株组织，按100 mL病毒澄清液加25 g硫酸铵的比例提纯病毒。
1.5.2电镜样品制备(负染法)
取1 mL活性蛋白与等量的TMV提纯液混合，以无菌水混合为对照，在室温下(25℃)放置25 min后，用带膜样品载网膜面向下吸附1～3 min，取出滤纸吸干。用镊子移到磷钨酸(2％，pH6.7)中，染色1～2 min，取出滤纸吸干染液，放在垫有滤纸的平皿中，干燥后在JEM－100CX(放大倍数3 000×1.45)透射电镜下，观察病毒粒体形态。
2、结果与分析
2.1活性蛋白CZ对NC89烟叶片内POD活性的影响
活性蛋白CZ对NC89烟叶片内POD活性影响结果见图1。
图2表明，活性蛋白CZ处理NC89烟后，第1～12天其叶片内PAL活性一直呈上升趋势，而只接种TMV的叶片内PAL的活性在第1～5天有所下降，第5～12天虽然也呈上升趋势，但上升幅度和活性都明显低于活性蛋白CZ处理的叶片。第12～16天，几种处理叶片中PAL活性虽然都呈下降趋势，然而活性蛋白CZ处理的叶片中PAL的活性高于其他对照处理。
2.3活性蛋白CZ处理对NC89烟叶片内叶绿素含量的影响
活性蛋白CZ对NC89烟叶片内叶绿素含量影响的结果见图3。
由图3可见，NC89烟经各处理后1～16 d内，叶片内叶绿素含量均呈下降趋势，然而经活性蛋白CZ处理的烟草叶片内叶绿素含量的下降幅度略缓于其他处理，且其含量也高于其他处理。
2.5活性蛋白对TMV粒体形态的影响
通过JEM一100CX电镜观察TMV的粒体形态：TMV与无菌水混合的图片(图5)，TMV粒体刚直、匀称，呈杆状，排列规则。而TMV与活性蛋白CZ混合的图片，TMV粒体小片段数目多，排列凌乱，呈聚集状(图6)。这可能是因为活性蛋白破坏了病毒衣壳蛋白亚基之间的作用力，导致病毒粒体断裂，结构松散，排列凌乱，而小片段的病毒侵染力降低。
3、结论与讨论
植物病毒病是农业生产中危害非常广泛而严重的一类植物病害。一般来说，抗病毒剂抗病毒作用主要表现在以下几个方面：直接作用于病毒、作用于寄主上病毒侵染接受位点、诱导植物产生抗性及抑制病毒复制。近年来大量研究表明，植物叶绿素含量及其防御酶系统的变化与植物的抗病毒性关系密切。
(1)经各处理后，NC89烟叶片内POD活性及膜质过氧化产物丙二醛(MDA)含量发生了明显的变化，表明TMV侵染NC89烟后，植株体内发生了活性氧的作用。近年研究发现，植物体内的活性氧代谢在植物的致病过程中起重要的作用。活性氧的清除主要通过POD等有关的酶和一些能与自由基反应产生稳定产物的有机分子共同担负的。其中POD是细胞体内重要的活性氧清除剂，能使活性氧维持在一个低水平，防止活性氧伤害。在植物生长发育过程中其活性不断发生变化。因此，测量这种酶可以反映某一时期植物体内代谢存在于植物细胞中清除自由基的主要酶之一。而通常MDA含量作为膜脂过氧化的指标，表明细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱，MDA值越高说明病毒对于植物细胞组织的破坏越强。本研究结果表明，NC89烟经活性蛋白CZ处理后，叶片中POD活性增加，MDA含量降低，这表明活性蛋白CZ对TMV的拮抗作用可能与活性氧代谢有关，即可减少活性氧对植物的毒害作用。
(2)在高等植物次生代谢物中，PAL是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用，是植物诱导抗病性的常用的酶活指标。本试验结果表明，经活性蛋白CZ处理后，NC89烟叶片内的PAL活性均比对照增加，其酶活性的提高可能导致细胞壁的木质化作用的加强和细胞内植保素的形成，细胞壁的木质化加强可能阻止病毒的侵染；植株体内的植保素也可能对病毒有影响，这需要进一步研究。
(3)活性蛋白CZ可诱导叶绿素含量升高而增强寄主植物的抗病性植物叶片中的叶绿素含量与植物抗病毒能力关系密切，叶绿素含量高，光合作用强，植物生长旺盛，抗病性和耐病性增强。当病毒侵染叶片后，不断增值扩展，而且能和叶绿体发生相互作用，导致叶绿体的解体，发病严重的叶绿素合成受阻，叶片黄化褪绿，出现花叶症状，因此叶绿素含量高低可以客观地反映植物对病毒抗性的强弱。目前，有许多抗病毒剂含有激素或具有激素活性，可刺激植物生长而提高其抗病性。研究结果表明，烟草经活性蛋白CZ处理后，其叶片中的叶绿素含量高于其他处理，说明活性蛋白CZ增强寄主植物的抗病性，但关于其机理则有待于进一步探讨。
(4)本试验筛选出的对TMV有拮抗作用的菌株，其分泌的抗病毒蛋白对TMV粒子亦有体外钝化作用；电镜下观察到抗病毒蛋白打破TMV粒子的规则排列，有一定的聚集作用，从而降低病毒粒子的侵染力，具有研究价值。
关键词：烟草；烟草花叶病毒；活性氧防御酶系统；活性蛋白
中图分类号：S 435，72，S 476，8
Verma等发现Clerodendrum aculeatum的叶片提取液可以系统诱导植物产生抗性；其机制是提取液中的一种碱性蛋白可以诱导寄主产生一种抗病毒的蛋白阻止病毒的侵入。近年来，有关植物的抗性与活性氧代谢的关系备受人们的关注。细菌蛋白CZ是本实验室人员在烟草种子周围细菌发酵产物中提纯得到的一种抗病毒蛋白。研究表明，CZ对烟草花叶病毒病有明显的控制作用，兼具保护作用，防效在54.74％～85.67％。电镜下观察到活性蛋白能打破TMV粒体的规则排列，与TMV粒子不可逆的结合，从而降低侵染力。本试验以NC89、TMV为材料，从植物叶绿素含量及其防御酶系统变化的角度探讨CZ的防病机理，为其应用提供可靠的理论依据。
1、材料与方法
1.1材料
普通烟NC89；TMV毒源保存在普通烟NC89烟上，细菌蛋白CZ由本实验室提纯制备，使用浓度为1.0614/μg/μL。
1.2处理植株
NC89在防虫温室中培养(20～27℃)，选择5～6叶期，长势一致、健壮的烟株供试。试验设预防处理1和2，先用脱脂棉蘸取药剂涂叶片施药12 h后接种，另设对照只接种不施药为处理3，药剂为有一定浓度的活性蛋白CZ和3％超微蛋白微粒剂(康壮素，美国伊甸生物技术公司产品)，供试药剂，共3个处理，每处理10株，重复3次，处理方法具体见表1。处理后1、5、8、12、16 d分别取各处理同一生育期、同一层次、同一叶位的叶片进行POD活性、PAL活性、MDA含量及叶绿素含量的测定。
1.3接种方法
采用常规汁液摩擦接种法接种，取病叶加去离子水研磨，(病汁液浓度为1 g病叶加80 mL水)，接种。
1.4酶活性及MDA、叶绿素含量测定
MDA含量采用张志良等的方法测定；叶绿素含量的测定采用张宪政等丙酮乙醇混合法；POD活性的测定采用愈创木酚法；PAL活性的测定按薛应龙等的方法提取和测定。
1.5电镜观察活性蛋白CZ对TMV粒体的影响
1.5.1烟草花叶病毒的提纯
TMV活体毒源NC89叶片100 g，研磨，离心去植株组织，按100 mL病毒澄清液加25 g硫酸铵的比例提纯病毒。
1.5.2电镜样品制备(负染法)
取1 mL活性蛋白与等量的TMV提纯液混合，以无菌水混合为对照，在室温下(25℃)放置25 min后，用带膜样品载网膜面向下吸附1～3 min，取出滤纸吸干。用镊子移到磷钨酸(2％，pH6.7)中，染色1～2 min，取出滤纸吸干染液，放在垫有滤纸的平皿中，干燥后在JEM－100CX(放大倍数3 000×1.45)透射电镜下，观察病毒粒体形态。
2、结果与分析
2.1活性蛋白CZ对NC89烟叶片内POD活性的影响
活性蛋白CZ对NC89烟叶片内POD活性影响结果见图1。
图2表明，活性蛋白CZ处理NC89烟后，第1～12天其叶片内PAL活性一直呈上升趋势，而只接种TMV的叶片内PAL的活性在第1～5天有所下降，第5～12天虽然也呈上升趋势，但上升幅度和活性都明显低于活性蛋白CZ处理的叶片。第12～16天，几种处理叶片中PAL活性虽然都呈下降趋势，然而活性蛋白CZ处理的叶片中PAL的活性高于其他对照处理。
2.3活性蛋白CZ处理对NC89烟叶片内叶绿素含量的影响
活性蛋白CZ对NC89烟叶片内叶绿素含量影响的结果见图3。
由图3可见，NC89烟经各处理后1～16 d内，叶片内叶绿素含量均呈下降趋势，然而经活性蛋白CZ处理的烟草叶片内叶绿素含量的下降幅度略缓于其他处理，且其含量也高于其他处理。
2.5活性蛋白对TMV粒体形态的影响
通过JEM一100CX电镜观察TMV的粒体形态：TMV与无菌水混合的图片(图5)，TMV粒体刚直、匀称，呈杆状，排列规则。而TMV与活性蛋白CZ混合的图片，TMV粒体小片段数目多，排列凌乱，呈聚集状(图6)。这可能是因为活性蛋白破坏了病毒衣壳蛋白亚基之间的作用力，导致病毒粒体断裂，结构松散，排列凌乱，而小片段的病毒侵染力降低。
3、结论与讨论
植物病毒病是农业生产中危害非常广泛而严重的一类植物病害。一般来说，抗病毒剂抗病毒作用主要表现在以下几个方面：直接作用于病毒、作用于寄主上病毒侵染接受位点、诱导植物产生抗性及抑制病毒复制。近年来大量研究表明，植物叶绿素含量及其防御酶系统的变化与植物的抗病毒性关系密切。
(1)经各处理后，NC89烟叶片内POD活性及膜质过氧化产物丙二醛(MDA)含量发生了明显的变化，表明TMV侵染NC89烟后，植株体内发生了活性氧的作用。近年研究发现，植物体内的活性氧代谢在植物的致病过程中起重要的作用。活性氧的清除主要通过POD等有关的酶和一些能与自由基反应产生稳定产物的有机分子共同担负的。其中POD是细胞体内重要的活性氧清除剂，能使活性氧维持在一个低水平，防止活性氧伤害。在植物生长发育过程中其活性不断发生变化。因此，测量这种酶可以反映某一时期植物体内代谢存在于植物细胞中清除自由基的主要酶之一。而通常MDA含量作为膜脂过氧化的指标，表明细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱，MDA值越高说明病毒对于植物细胞组织的破坏越强。本研究结果表明，NC89烟经活性蛋白CZ处理后，叶片中POD活性增加，MDA含量降低，这表明活性蛋白CZ对TMV的拮抗作用可能与活性氧代谢有关，即可减少活性氧对植物的毒害作用。
(2)在高等植物次生代谢物中，PAL是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用，是植物诱导抗病性的常用的酶活指标。本试验结果表明，经活性蛋白CZ处理后，NC89烟叶片内的PAL活性均比对照增加，其酶活性的提高可能导致细胞壁的木质化作用的加强和细胞内植保素的形成，细胞壁的木质化加强可能阻止病毒的侵染；植株体内的植保素也可能对病毒有影响，这需要进一步研究。
(3)活性蛋白CZ可诱导叶绿素含量升高而增强寄主植物的抗病性植物叶片中的叶绿素含量与植物抗病毒能力关系密切，叶绿素含量高，光合作用强，植物生长旺盛，抗病性和耐病性增强。当病毒侵染叶片后，不断增值扩展，而且能和叶绿体发生相互作用，导致叶绿体的解体，发病严重的叶绿素合成受阻，叶片黄化褪绿，出现花叶症状，因此叶绿素含量高低可以客观地反映植物对病毒抗性的强弱。目前，有许多抗病毒剂含有激素或具有激素活性，可刺激植物生长而提高其抗病性。研究结果表明，烟草经活性蛋白CZ处理后，其叶片中的叶绿素含量高于其他处理，说明活性蛋白CZ增强寄主植物的抗病性，但关于其机理则有待于进一步探讨。
(4)本试验筛选出的对TMV有拮抗作用的菌株，其分泌的抗病毒蛋白对TMV粒子亦有体外钝化作用；电镜下观察到抗病毒蛋白打破TMV粒子的规则排列，有一定的聚集作用，从而降低病毒粒子的侵染力，具有研究价值。