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摘要 无绿藻是一种普遍存在的微藻，属于绿球藻，可引起人类和动物广泛地感染，其中的左氏无绿藻与一种严重的牛乳腺炎有关。该研究采集江苏部分地区患乳房炎奶牛奶样，用绵羊血琼脂培养、分离，用革兰氏染色镜检及PCR方法确定得到4株左氏无绿藻（P.zopfii）。这是首次在江苏地区发现奶牛源左氏无绿藻。
关键词 奶牛乳房炎 ；左氏无绿藻； PCR鉴定
中图分类号 S852.66文献标识码
A文章编号 0517-6611（2018）01-0078-02
Abstract Prototheca is a widespread microalgae，which belongs to Chlorococcum sp.People and animal can commomly infect prototheca.Among of them ， Prototheca zopfii was related to severe mastitis of cow.Milk samples of cow having mastitis were collected from part of Jiangsu.4 P. zopfii were identified by gram stain microscopy and PCR method using sheep blood agar to cultur and isolate them. P. zopfii sourced from cowed was first discovered in Jiangsu area.
Key words Cow mastitis； Prototheca zopfii； PCR identification
无绿藻是一种和绿藻相近的无叶绿素藻类，是自然界一种常见条件致病真菌，可广泛存在于污水、土壤、植物及动物中；无绿藻病可引起人与动物的感染。在牛的无绿藻感染症中，其多表现为顽固性乳房炎，因无绿藻的菌落形态与酵母样真菌类似，故而在临床诊断中容易发生误诊。
从1894年Kruger发现无绿藻后，陆续确认了6种无绿藻： Prototheca moriformis（1894）、Prototheca stagnora（1985）、Prototheca ulemea（1986）、Prototheca wickerhamii（1959）、Prototheca zopfii（1894）、Prototheca blaschkeae（2006）。
在1952年，左氏无绿藻首次被确定为奶牛乳房炎的致病菌[1-3]，能引起奶牛产奶量急剧下降，乳房轻度肿胀，乳汁呈水样，伴有絮状沉淀，且对抗生素治疗效果不佳[4-6]，容易成为感染源，故最好的控制方法就是淘汰患病牛只。左氏无绿藻感染奶牛后易造成严重的经济损失，并对食品公共安全存在潜在的威胁。
无绿藻引起的乳房炎在德国、美国、意大利、葡萄牙、英国、日本和西班牙等国家被广泛报道，目前国内鲜有相关的报道，因而对无绿藻性临床型乳房炎的诊断及其危害评估和防控具有很大的必要性和迫切性[7]。
1 材料与方法
1.1 试剂
新鲜脱脂绵羊鲜血（杭州微生物有限公司），琼脂粉，革兰染色液（广州蕊特科技有限公司），PCR Mast mix（Dye plus） （诺唯赞生物科技有限公司）；试剂盒：细菌基因组DNA提取试剂盒（GenScript）。
1.2 培养基
绵羊血琼脂培养基，配制方法
参考文献[8]，改良马丁培养基，购自青岛高科园海博生物技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 左氏无绿藻的分离。从江苏部分养殖场患乳房炎的奶牛采集好奶样，4 ℃保存。分离奶样中细菌时，先将采样管中奶样摇匀，在无菌条件下，取出100 μL奶样，均匀涂布到60 mm规格的血琼脂平板上，在超净台内晾干后，在37 ℃恒温培养箱倒置培养24 h，然后观察菌落，根据其颜色、形态、溶血性、数目（菌落数目小于3的舍弃），分别挑取可疑单菌落划线接种于绵羊血鲜血培养基上进行纯化培养，37 ℃恒温培养箱中48 h。挑取单菌落分别进行革兰染色并在1 000倍光镜下进行形态学观察。
1.3.2 PCR鉴定左氏无绿藻。
特异性PCR分析4个左氏无绿藻分离株的18S rRNA。酵母样细胞在改良马丁固体培养基上37 ℃培养48 h后用于基因提纯。使用GenScript细菌DNA提纯试剂盒提取基因组DNA，溶解在50 μL的超纯水中。
左氏无绿藻的鉴定采用PCR方法，参考文献[9]选用引物Proto18-4f（5′-GACATGGCGAGGATTGACAGA-3′）和Proto18-4r（5′-AGCACACCCAATCGGTAGGA-3′）進行鉴定，目的条带大小450 bp。
20 μL PCR扩增体系如下：1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，1 μL DNA模板，7 μL ddH2O，10 μL 2× Taq Master Mix（Dye Plus）；5 min 95 ℃ 32个循环，模板变性（1 min 95 ℃），引物退火（1 min 57 ℃），聚合（45 s 72 ℃），10 min 72 ℃，PCR产物在2%的琼脂进行电泳（80 V，80 min），用Gelsafe进行显色。
对阳性PCR产物进行测序分析。
2 结果与分析
2.1 左氏无绿藻革兰氏染色结果 单菌落经革兰氏染色可见大的球形细胞、中央区着深紫色、边缘红染[10]。
2.2 不同培养基纯化培养
2.2.1 绵羊血琼脂生长情况。4个分离株在37 ℃、48 h绵羊血琼脂培养结果（图2），在血平板上生长较缓慢为点状白色圆形。 2.2.2 改良马丁培养基生长情况。37 ℃，48 h改良马丁培养基中纯化培养结果（图3），生长良好，菌落呈白色，圆形，边缘皱褶，表面呈颗粒状。
2.3 PCR鉴定结果 PCR结果显示编号1、2、3、4菌种在约450 bp处有阳性条带（图4），将测序结果进行BLAST比对，与GenBank公布的左氏无绿藻相关基因同源性达99%。
3 结论与讨论
该研究基于左氏无绿藻的形态学特征、镜检特点、分子生物学特征进行鉴定，最终确定4个分离株为左氏无绿藻。与血平板生长状况相比较，左氏无绿藻在改良马丁固体培养基（pH 6.4±0.2）上生长较好，菌落较大，颜色发白，表面呈颗粒状，革兰氏染色后可见边缘浅红色的孢囊。另外，左氏无绿藻的生长速度相对于细菌较慢，因此在收集奶样时要严格按照标准程序进行无菌采集，否则会因细菌的快速生长而影响对无绿藻的检测[11]，恒温培养需要较长的培养时间。
左氏无绿藻能引起动物疾病，并通过牛奶传染给人类。左氏无绿藻不仅对绝大多数抗生素耐药[12]，而且该病原对巴氏消毒法具有耐受性[13]，从而能引起人類肠道感染和肠炎。因此，确认食用牛奶中左氏无绿藻的存在非常重要，它们对人类健康有潜在的危害。
参考文献
[1] COSTA E O，CARCIO A C，MELVILLE P A，et al. Prototheca sp.outbreak of bovine mastitis[J].Zentralbl veterinarmed B，1996，43（6）：321-324.
[2] J′ANOSI S，R′ATZ F，SZIGETI G，et al.Review of the microbiological，pathological，and clinical aspects of bovine mastitis caused by the alga Prototheca zopfii [J].Vet Q，2001，23（2）：58-61.
[3] ROESLER U，HENSEL A.Longitudinal analysis of Prototheca zopfii-specific immune responses：Correlation with disease progression and carriage in dairy cows[J].J Clin Microbiol，2003，41（3）：1181-1186.
[4] MARQUES S，SILVA E，CARVALHERIA J，et al.Short communication： In vitro antimicrobial susceptibility of Protothrca wickerhamii and Prototheca zopfii isolated from bovine mastitis[J].Journal of dairy science，2006，89（11）：4202-4204.
[5] CORBELLINI L G，DRIEMEIER D，CRUZ C，et al.Bovine mastitis due to Protootheca zopfii： Clinical，epidemiological and pathological aspects in a Brazilian dairy herd[J].Tropical animal health and production，2001，33（6）：463-470.
[6] TORTORANO A M，PRIGITANO A，DHO G，et al. In vitro activity of conventional antifunngal drugs and natural essences against the yeast-like alga Prototheca [J].J Antimicrob Chemother，2008，61（6）：1312-1314.
[7] GAO J，ZHANG H Q，HE J Z，et al.Characterization of Prototheca zopfii associated with outbreak of bovine clinical mastitis in herd of Beijing，China[J].Mycopathologia，2012，173（4）：275-281.
[8] 陈天寿.微生物培养基的制造与应用配制[M].北京：中国农业出版社，1995.
[9] ROESLER U，MOLLER A，HENSEL A，et al.Diversity within the current algal species Prototheca zopfii ：A proposal for two Prototeca zopfii genotypes and description of a novel species， Prototheca blaschkeae sp.nov[J].Int J Syst Evol Microbiol，2006，56（6）：1419-1425.
[10] 张寒琪，高健，吴桥兴，等.奶牛中型无绿藻性乳房炎[J].中国兽医杂志，2011，47（5）：13-14.
[11] TENHAGEN B A，KALBE P，KLNDER G，et al.Individual animal risk factors for Prototheca mastitis in cattle[J].Dtsch tierarztl wochenschr，1999，106（9）：376-380.
[12] WAWRON W，BOCHNIARZ M，PIECH T，et al.Antimicrobial susceptibility of Prototheca zopfii isolated from bovine mastitis[J].Bull Vet Inst Pulawy，2013，57（4）：485-488.
[13] LASSA H，JAGIELSKI T，MALINOWSKI E.Effect of different heat treatments and disinfectants on the survival of Prototheca zopfii [J].Mycopathologia ，2011，171（3）：177-182.
关键词 奶牛乳房炎 ；左氏无绿藻； PCR鉴定
中图分类号 S852.66文献标识码
A文章编号 0517-6611（2018）01-0078-02
Abstract Prototheca is a widespread microalgae，which belongs to Chlorococcum sp.People and animal can commomly infect prototheca.Among of them ， Prototheca zopfii was related to severe mastitis of cow.Milk samples of cow having mastitis were collected from part of Jiangsu.4 P. zopfii were identified by gram stain microscopy and PCR method using sheep blood agar to cultur and isolate them. P. zopfii sourced from cowed was first discovered in Jiangsu area.
Key words Cow mastitis； Prototheca zopfii； PCR identification
无绿藻是一种和绿藻相近的无叶绿素藻类，是自然界一种常见条件致病真菌，可广泛存在于污水、土壤、植物及动物中；无绿藻病可引起人与动物的感染。在牛的无绿藻感染症中，其多表现为顽固性乳房炎，因无绿藻的菌落形态与酵母样真菌类似，故而在临床诊断中容易发生误诊。
从1894年Kruger发现无绿藻后，陆续确认了6种无绿藻： Prototheca moriformis（1894）、Prototheca stagnora（1985）、Prototheca ulemea（1986）、Prototheca wickerhamii（1959）、Prototheca zopfii（1894）、Prototheca blaschkeae（2006）。
在1952年，左氏无绿藻首次被确定为奶牛乳房炎的致病菌[1-3]，能引起奶牛产奶量急剧下降，乳房轻度肿胀，乳汁呈水样，伴有絮状沉淀，且对抗生素治疗效果不佳[4-6]，容易成为感染源，故最好的控制方法就是淘汰患病牛只。左氏无绿藻感染奶牛后易造成严重的经济损失，并对食品公共安全存在潜在的威胁。
无绿藻引起的乳房炎在德国、美国、意大利、葡萄牙、英国、日本和西班牙等国家被广泛报道，目前国内鲜有相关的报道，因而对无绿藻性临床型乳房炎的诊断及其危害评估和防控具有很大的必要性和迫切性[7]。
1 材料与方法
1.1 试剂
新鲜脱脂绵羊鲜血（杭州微生物有限公司），琼脂粉，革兰染色液（广州蕊特科技有限公司），PCR Mast mix（Dye plus） （诺唯赞生物科技有限公司）；试剂盒：细菌基因组DNA提取试剂盒（GenScript）。
1.2 培养基
绵羊血琼脂培养基，配制方法
参考文献[8]，改良马丁培养基，购自青岛高科园海博生物技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 左氏无绿藻的分离。从江苏部分养殖场患乳房炎的奶牛采集好奶样，4 ℃保存。分离奶样中细菌时，先将采样管中奶样摇匀，在无菌条件下，取出100 μL奶样，均匀涂布到60 mm规格的血琼脂平板上，在超净台内晾干后，在37 ℃恒温培养箱倒置培养24 h，然后观察菌落，根据其颜色、形态、溶血性、数目（菌落数目小于3的舍弃），分别挑取可疑单菌落划线接种于绵羊血鲜血培养基上进行纯化培养，37 ℃恒温培养箱中48 h。挑取单菌落分别进行革兰染色并在1 000倍光镜下进行形态学观察。
1.3.2 PCR鉴定左氏无绿藻。
特异性PCR分析4个左氏无绿藻分离株的18S rRNA。酵母样细胞在改良马丁固体培养基上37 ℃培养48 h后用于基因提纯。使用GenScript细菌DNA提纯试剂盒提取基因组DNA，溶解在50 μL的超纯水中。
左氏无绿藻的鉴定采用PCR方法，参考文献[9]选用引物Proto18-4f（5′-GACATGGCGAGGATTGACAGA-3′）和Proto18-4r（5′-AGCACACCCAATCGGTAGGA-3′）進行鉴定，目的条带大小450 bp。
20 μL PCR扩增体系如下：1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，1 μL DNA模板，7 μL ddH2O，10 μL 2× Taq Master Mix（Dye Plus）；5 min 95 ℃ 32个循环，模板变性（1 min 95 ℃），引物退火（1 min 57 ℃），聚合（45 s 72 ℃），10 min 72 ℃，PCR产物在2%的琼脂进行电泳（80 V，80 min），用Gelsafe进行显色。
对阳性PCR产物进行测序分析。
2 结果与分析
2.1 左氏无绿藻革兰氏染色结果 单菌落经革兰氏染色可见大的球形细胞、中央区着深紫色、边缘红染[10]。
2.2 不同培养基纯化培养
2.2.1 绵羊血琼脂生长情况。4个分离株在37 ℃、48 h绵羊血琼脂培养结果（图2），在血平板上生长较缓慢为点状白色圆形。 2.2.2 改良马丁培养基生长情况。37 ℃，48 h改良马丁培养基中纯化培养结果（图3），生长良好，菌落呈白色，圆形，边缘皱褶，表面呈颗粒状。
2.3 PCR鉴定结果 PCR结果显示编号1、2、3、4菌种在约450 bp处有阳性条带（图4），将测序结果进行BLAST比对，与GenBank公布的左氏无绿藻相关基因同源性达99%。
3 结论与讨论
该研究基于左氏无绿藻的形态学特征、镜检特点、分子生物学特征进行鉴定，最终确定4个分离株为左氏无绿藻。与血平板生长状况相比较，左氏无绿藻在改良马丁固体培养基（pH 6.4±0.2）上生长较好，菌落较大，颜色发白，表面呈颗粒状，革兰氏染色后可见边缘浅红色的孢囊。另外，左氏无绿藻的生长速度相对于细菌较慢，因此在收集奶样时要严格按照标准程序进行无菌采集，否则会因细菌的快速生长而影响对无绿藻的检测[11]，恒温培养需要较长的培养时间。
左氏无绿藻能引起动物疾病，并通过牛奶传染给人类。左氏无绿藻不仅对绝大多数抗生素耐药[12]，而且该病原对巴氏消毒法具有耐受性[13]，从而能引起人類肠道感染和肠炎。因此，确认食用牛奶中左氏无绿藻的存在非常重要，它们对人类健康有潜在的危害。
参考文献
[1] COSTA E O，CARCIO A C，MELVILLE P A，et al. Prototheca sp.outbreak of bovine mastitis[J].Zentralbl veterinarmed B，1996，43（6）：321-324.
[2] J′ANOSI S，R′ATZ F，SZIGETI G，et al.Review of the microbiological，pathological，and clinical aspects of bovine mastitis caused by the alga Prototheca zopfii [J].Vet Q，2001，23（2）：58-61.
[3] ROESLER U，HENSEL A.Longitudinal analysis of Prototheca zopfii-specific immune responses：Correlation with disease progression and carriage in dairy cows[J].J Clin Microbiol，2003，41（3）：1181-1186.
[4] MARQUES S，SILVA E，CARVALHERIA J，et al.Short communication： In vitro antimicrobial susceptibility of Protothrca wickerhamii and Prototheca zopfii isolated from bovine mastitis[J].Journal of dairy science，2006，89（11）：4202-4204.
[5] CORBELLINI L G，DRIEMEIER D，CRUZ C，et al.Bovine mastitis due to Protootheca zopfii： Clinical，epidemiological and pathological aspects in a Brazilian dairy herd[J].Tropical animal health and production，2001，33（6）：463-470.
[6] TORTORANO A M，PRIGITANO A，DHO G，et al. In vitro activity of conventional antifunngal drugs and natural essences against the yeast-like alga Prototheca [J].J Antimicrob Chemother，2008，61（6）：1312-1314.
[7] GAO J，ZHANG H Q，HE J Z，et al.Characterization of Prototheca zopfii associated with outbreak of bovine clinical mastitis in herd of Beijing，China[J].Mycopathologia，2012，173（4）：275-281.
[8] 陈天寿.微生物培养基的制造与应用配制[M].北京：中国农业出版社，1995.
[9] ROESLER U，MOLLER A，HENSEL A，et al.Diversity within the current algal species Prototheca zopfii ：A proposal for two Prototeca zopfii genotypes and description of a novel species， Prototheca blaschkeae sp.nov[J].Int J Syst Evol Microbiol，2006，56（6）：1419-1425.
[10] 张寒琪，高健，吴桥兴，等.奶牛中型无绿藻性乳房炎[J].中国兽医杂志，2011，47（5）：13-14.
[11] TENHAGEN B A，KALBE P，KLNDER G，et al.Individual animal risk factors for Prototheca mastitis in cattle[J].Dtsch tierarztl wochenschr，1999，106（9）：376-380.
[12] WAWRON W，BOCHNIARZ M，PIECH T，et al.Antimicrobial susceptibility of Prototheca zopfii isolated from bovine mastitis[J].Bull Vet Inst Pulawy，2013，57（4）：485-488.
[13] LASSA H，JAGIELSKI T，MALINOWSKI E.Effect of different heat treatments and disinfectants on the survival of Prototheca zopfii [J].Mycopathologia ，2011，171（3）：177-182.