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摘要：为了进一步探讨乌鳢（Channa argus）的分类地位及其系统发育关系，通过测定其线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]）基因部分序列，并从GenBank获取鳢科另外18种鱼类的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因同源序列，以银鲳（Pampus argenteus）为外群，采用非加权配对算术平均法（UPGMA）构建分子系统树。结果表明：（1）支持鳢科分为鳢属和副鳢属；（2）乌鳢与同属的斑鳢（C. maculata）等鱼类的亲缘关系较近。
关键词：乌鳢；CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]；序列测定；系统发育
中图分类号： S917文献标志码：
文章编号：1002-1302（2016）08-0297-03
鳢科隶属于鱼纲鲈形目，包括2属29种。其中鳢属26种，分布于中东、南亚和东亚等地；而副鳢属只有3种，主要分布于西非地区[1]。乌鳢（Channa argus）别称北方蛇头鱼、黑鱼、生鱼、乌鱼等，是鳢科鳢属中个体大、生长快、经济价值高的名贵经济鱼类。乌鳢原产于中国、俄罗斯和韩国，国内主要分布于长江和黑龙江流域的大部分地区[2]，通常栖息于水草丛生、底泥细软的静水或微流水中。因乌鳢具有肉质好、味道鲜美、营养丰富等特点，成为我国重要的淡水经济鱼类。长期以来，人们关于乌鳢的形态学、生态学以及人工养殖技术等方面的研究较多，而关于其分子生物学资料则很少，其分类地位和系统发育关系尚存争议。
线粒體DNA是真核生物细胞质中的遗传物质，呈母系遗传，具有分子量小、进化速度较快、拷贝数量多等特点，且不易发生重组现象，已成为研究物种起源、进化、分类及种群遗传分化的理想工具。与其他动物一样，线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]）基因是鱼类线粒体13个蛋白编码基因之一，中度保守，既能保证足够的变异又易于被通用引物扩增，在种群遗传学研究中，可作为属、种系统进化研究的良好标记，常被用于分析亲缘关系较近物种的系统发育以及地理种群之间系统关系的分子工具。已有研究表明，线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因是许多鱼类、昆虫和鸟类等动物分类与鉴别的最适DNA条形码之一[3-5]。
本研究对乌鳢线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因进行扩增和测序，并从GenBank下载部分鳢科鱼类的同源序列进行比较研究，初步分析它们之间的亲缘关系和系统进化关系，以期為乌鳢的系统进化及其种质资源的保护和利用进一步提供分子生物学依据。
1材料与方法
1.1材料
乌鳢，购自盐城市农贸市场，活体带回实验室后，用于DNA提取。
1.2总DNA提取
取约200 mg样品肌肉，采用传统的酚-三氯甲烷方法提取基因组DNA。DNA经沉淀、洗涤并干燥后，溶于100 μL TE缓冲液中，4 ℃冰箱保存备用。
1.3PCR扩增和测序
1.4数据分析
测序结果同GenBank中获得的其他18种鳢科鱼类的线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列合并（表1），用Clustal X 1.83软件比对，确定变异位点；用MEGA 4.1软件对序列进行分析，并基于Kimura双参数模型，计算上述不同序列的碱基组成、密码子不同位点的碱基含量，以及相互间的遗传距离等信息；以鲈形目鲳亚目鲳科的银鲳（Pampus argenteus）为外群，用非加权配对算术平均法（UPGMA）构建分子系统树，通过重抽样检验获得系统树分支的置信度（重复次数为1 000次）。
2结果与分析
2.1CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列分析
通过对乌鳢线粒体总DNA的提取、PCR扩增和序列测定，得到长度为708 bp的基因序列，经BLAST分析比较，证实所得序列为乌鳢CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因片段。分析该序列的碱基组成，其中T、C、A、G的含量分别为26.7%、31.1%、23.6%、 18.6%，A T含量为50.3%，G C含量为49.7%。从其碱基组成的偏向性看，G含量最低，A T含量略高于G C含量，这与其他鱼类线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因同源序列的碱基特点相似[7-10]。
2.2遗传距离及系统发育分析
遗传距离多用来分析不同群体间的遗传分化程度和群体内的遗传多样性，数值越大，群体内或群体间分化程度越高；数值越小，群体内或群体间分化程度越低。根据Kimura双参数模型得到19种鳢科鱼类之间的遗传距离，其中乌鳢与斑鳢的遗传距离最小，为0.002；乌鳢与月鳢等其他14种同属鱼类之间的遗传距离为0.178～0.241；而乌鳢与同科副鳢属3种鱼类的遗传距离则为0.239～0.253（表2）。可见，乌鳢与同属的斑鳢等鱼类间的分化程度较低，亲缘关系较近，与副鳢属鱼类之间的分化程度相对较高。
基于线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因部分序列，采用非加权配对算术平均法构建分子系统树。图1显示，相对于鲳科银鲳的外群，所有供分析鳢科的2属19种鱼类聚成1个单系群；在鳢科内部，16种鳢属鱼类聚在一起形成单系，3种副鳢属鱼类聚成另1支，两者互为姊妹群；乌鳢首先与斑鳢聚为1支，进而与由小盾鳢、红鳢、侧眼鳢组成的单系群形成姊妹群关系，且具有较高的置信度，说明乌鳢与这些物种的亲缘关系较近。
3讨论
细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]）为线粒体13个蛋白编码基因中研究得最清楚的基因之一。相对于线粒体其他序列如D-loop、Cyt b等，CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]的进化速率较低，被广泛用于鱼类系统发育及DNA条形码研究[11]。Hubert等通过对加拿大28科85属190种共1 360尾淡水鱼类样本的研究，得出DNA条形码可以有效应用于淡水鱼类、尤其是小个体鱼类分类学和系统学研究的结论[12]。近年来，国内学者也陆续开展了鱼类DNA条形码方面的研究工作，但迄今未见运用CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因作为乌鳢DNA条形码进行分类及其系统发育关系研究的报道。 为了进一步揭示乌鳢的分类地位及其系统发育关系，本研究通过分子生物学技术获得乌鳢线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因部分序列[CM（25]，联合GenBank中其他18种鳢科鱼类的
以其长度650 bp的同源序列为材料，进行遗传距离分析及系统进化关系研究。结果表明：鳢科鱼类明显分化为2支，分别代表鳢属和副鳢属，这与目前公认的鳢科分类观点一致[1，13]；鳢属中乌鳢与斑鳢的亲缘关系最近，与小盾鳢、红鳢、侧眼鳢等物种也有比较近的亲缘关系，这与Li等以线粒体ND2及其侧翼基因序列为材料所得到的研究结论[1]完全一致。
虽然本研究进一步验证了鳢科的分类状况，也进一步明确了乌鳢的分类地位及其系统发育关系，但由于受客观条件的限制，本研究仅仅基于CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因的部分序列，研究对象也仅涉及到鳢科29个物种中的19种，因而研究结果仍然是初步的，还有待于我们从更多的鳢科物种、基于更丰富的线粒体基因或核基因材料，对乌鳢分类地位及鳢科鱼类系统发育关系进行更加系统的研究。
参考文献：
[1]Li X，Musikasinthorn P，Kumazawa Y. Molecular phylogenetic analyses of snakeheads （Perciformes：Channidae） using mitochondrial DNA sequences[J]. Ichthyological Research，2006，53（2）：148-159.
[2]董新培，穆淑梅，周楠，等. 不同地理群體乌鳢线粒体DNA控制区结构分析及遗传多样性[J]. 水产学报，2014，38（9）：1277-1285.
[3]刘连为，许强华，陈新军. 基于线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]和Cytb基因序列的北太平洋柔鱼种群遗传结构研究[J]. 水产学报，2012，36（11）：1675-1684.
[4]张迪，雷光春，龚成，等. 基于CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的太湖新银鱼遗传多样性[J]. 湖泊科学，2012，24（2）：299-306.
[5]于亚男，宋超，侯俊利，等. 基于线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因部分序列的长江口虾虎鱼科鱼类系统分类[J]. 淡水渔业，2014，44（5）：3-8.
[6]Ivanova N V，Zemlak T S，Hanner R H，et al. Universal primer cocktails for fish DNA barcoding[J]. Molecular Ecology Notes，2007，7（4）：544-548.[HJ1.7mm]
[7]郭奕惠，喻达辉，黄桂菊，等. 中国主要养殖罗非鱼亲缘关系的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列分析[J]. 华中农业大学学报，2009，28（1）：75-79.
[8]孟玮，杨天燕，海萨，等. 基于线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的亚东鲑DNA条形码研究[J]. 水产学杂志，2010，23（1）：6-10.
[9]董丽娜，黄梓荣，艾红，等. 北部灣3种金线鱼属鱼类CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的比较分析[J]. 中国水产科学，2011，18（3）：508-514.[ZK）]
[10]赵明，宋炜，马春艳. 基于线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的棘头梅童鱼7个野生群体遗传结构分析[J]. 中国水产科学，2015，22（2）：233-242.
关键词：乌鳢；CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]；序列测定；系统发育
中图分类号： S917文献标志码：
文章编号：1002-1302（2016）08-0297-03
鳢科隶属于鱼纲鲈形目，包括2属29种。其中鳢属26种，分布于中东、南亚和东亚等地；而副鳢属只有3种，主要分布于西非地区[1]。乌鳢（Channa argus）别称北方蛇头鱼、黑鱼、生鱼、乌鱼等，是鳢科鳢属中个体大、生长快、经济价值高的名贵经济鱼类。乌鳢原产于中国、俄罗斯和韩国，国内主要分布于长江和黑龙江流域的大部分地区[2]，通常栖息于水草丛生、底泥细软的静水或微流水中。因乌鳢具有肉质好、味道鲜美、营养丰富等特点，成为我国重要的淡水经济鱼类。长期以来，人们关于乌鳢的形态学、生态学以及人工养殖技术等方面的研究较多，而关于其分子生物学资料则很少，其分类地位和系统发育关系尚存争议。
线粒體DNA是真核生物细胞质中的遗传物质，呈母系遗传，具有分子量小、进化速度较快、拷贝数量多等特点，且不易发生重组现象，已成为研究物种起源、进化、分类及种群遗传分化的理想工具。与其他动物一样，线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]）基因是鱼类线粒体13个蛋白编码基因之一，中度保守，既能保证足够的变异又易于被通用引物扩增，在种群遗传学研究中，可作为属、种系统进化研究的良好标记，常被用于分析亲缘关系较近物种的系统发育以及地理种群之间系统关系的分子工具。已有研究表明，线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因是许多鱼类、昆虫和鸟类等动物分类与鉴别的最适DNA条形码之一[3-5]。
本研究对乌鳢线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因进行扩增和测序，并从GenBank下载部分鳢科鱼类的同源序列进行比较研究，初步分析它们之间的亲缘关系和系统进化关系，以期為乌鳢的系统进化及其种质资源的保护和利用进一步提供分子生物学依据。
1材料与方法
1.1材料
乌鳢，购自盐城市农贸市场，活体带回实验室后，用于DNA提取。
1.2总DNA提取
取约200 mg样品肌肉，采用传统的酚-三氯甲烷方法提取基因组DNA。DNA经沉淀、洗涤并干燥后，溶于100 μL TE缓冲液中，4 ℃冰箱保存备用。
1.3PCR扩增和测序
1.4数据分析
测序结果同GenBank中获得的其他18种鳢科鱼类的线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列合并（表1），用Clustal X 1.83软件比对，确定变异位点；用MEGA 4.1软件对序列进行分析，并基于Kimura双参数模型，计算上述不同序列的碱基组成、密码子不同位点的碱基含量，以及相互间的遗传距离等信息；以鲈形目鲳亚目鲳科的银鲳（Pampus argenteus）为外群，用非加权配对算术平均法（UPGMA）构建分子系统树，通过重抽样检验获得系统树分支的置信度（重复次数为1 000次）。
2结果与分析
2.1CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列分析
通过对乌鳢线粒体总DNA的提取、PCR扩增和序列测定，得到长度为708 bp的基因序列，经BLAST分析比较，证实所得序列为乌鳢CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因片段。分析该序列的碱基组成，其中T、C、A、G的含量分别为26.7%、31.1%、23.6%、 18.6%，A T含量为50.3%，G C含量为49.7%。从其碱基组成的偏向性看，G含量最低，A T含量略高于G C含量，这与其他鱼类线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因同源序列的碱基特点相似[7-10]。
2.2遗传距离及系统发育分析
遗传距离多用来分析不同群体间的遗传分化程度和群体内的遗传多样性，数值越大，群体内或群体间分化程度越高；数值越小，群体内或群体间分化程度越低。根据Kimura双参数模型得到19种鳢科鱼类之间的遗传距离，其中乌鳢与斑鳢的遗传距离最小，为0.002；乌鳢与月鳢等其他14种同属鱼类之间的遗传距离为0.178～0.241；而乌鳢与同科副鳢属3种鱼类的遗传距离则为0.239～0.253（表2）。可见，乌鳢与同属的斑鳢等鱼类间的分化程度较低，亲缘关系较近，与副鳢属鱼类之间的分化程度相对较高。
基于线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因部分序列，采用非加权配对算术平均法构建分子系统树。图1显示，相对于鲳科银鲳的外群，所有供分析鳢科的2属19种鱼类聚成1个单系群；在鳢科内部，16种鳢属鱼类聚在一起形成单系，3种副鳢属鱼类聚成另1支，两者互为姊妹群；乌鳢首先与斑鳢聚为1支，进而与由小盾鳢、红鳢、侧眼鳢组成的单系群形成姊妹群关系，且具有较高的置信度，说明乌鳢与这些物种的亲缘关系较近。
3讨论
细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]）为线粒体13个蛋白编码基因中研究得最清楚的基因之一。相对于线粒体其他序列如D-loop、Cyt b等，CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]的进化速率较低，被广泛用于鱼类系统发育及DNA条形码研究[11]。Hubert等通过对加拿大28科85属190种共1 360尾淡水鱼类样本的研究，得出DNA条形码可以有效应用于淡水鱼类、尤其是小个体鱼类分类学和系统学研究的结论[12]。近年来，国内学者也陆续开展了鱼类DNA条形码方面的研究工作，但迄今未见运用CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因作为乌鳢DNA条形码进行分类及其系统发育关系研究的报道。 为了进一步揭示乌鳢的分类地位及其系统发育关系，本研究通过分子生物学技术获得乌鳢线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因部分序列[CM（25]，联合GenBank中其他18种鳢科鱼类的
以其长度650 bp的同源序列为材料，进行遗传距离分析及系统进化关系研究。结果表明：鳢科鱼类明显分化为2支，分别代表鳢属和副鳢属，这与目前公认的鳢科分类观点一致[1，13]；鳢属中乌鳢与斑鳢的亲缘关系最近，与小盾鳢、红鳢、侧眼鳢等物种也有比较近的亲缘关系，这与Li等以线粒体ND2及其侧翼基因序列为材料所得到的研究结论[1]完全一致。
虽然本研究进一步验证了鳢科的分类状况，也进一步明确了乌鳢的分类地位及其系统发育关系，但由于受客观条件的限制，本研究仅仅基于CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因的部分序列，研究对象也仅涉及到鳢科29个物种中的19种，因而研究结果仍然是初步的，还有待于我们从更多的鳢科物种、基于更丰富的线粒体基因或核基因材料，对乌鳢分类地位及鳢科鱼类系统发育关系进行更加系统的研究。
参考文献：
[1]Li X，Musikasinthorn P，Kumazawa Y. Molecular phylogenetic analyses of snakeheads （Perciformes：Channidae） using mitochondrial DNA sequences[J]. Ichthyological Research，2006，53（2）：148-159.
[2]董新培，穆淑梅，周楠，等. 不同地理群體乌鳢线粒体DNA控制区结构分析及遗传多样性[J]. 水产学报，2014，38（9）：1277-1285.
[3]刘连为，许强华，陈新军. 基于线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]和Cytb基因序列的北太平洋柔鱼种群遗传结构研究[J]. 水产学报，2012，36（11）：1675-1684.
[4]张迪，雷光春，龚成，等. 基于CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的太湖新银鱼遗传多样性[J]. 湖泊科学，2012，24（2）：299-306.
[5]于亚男，宋超，侯俊利，等. 基于线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因部分序列的长江口虾虎鱼科鱼类系统分类[J]. 淡水渔业，2014，44（5）：3-8.
[6]Ivanova N V，Zemlak T S，Hanner R H，et al. Universal primer cocktails for fish DNA barcoding[J]. Molecular Ecology Notes，2007，7（4）：544-548.[HJ1.7mm]
[7]郭奕惠，喻达辉，黄桂菊，等. 中国主要养殖罗非鱼亲缘关系的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列分析[J]. 华中农业大学学报，2009，28（1）：75-79.
[8]孟玮，杨天燕，海萨，等. 基于线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的亚东鲑DNA条形码研究[J]. 水产学杂志，2010，23（1）：6-10.
[9]董丽娜，黄梓荣，艾红，等. 北部灣3种金线鱼属鱼类CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的比较分析[J]. 中国水产科学，2011，18（3）：508-514.[ZK）]
[10]赵明，宋炜，马春艳. 基于线粒体CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的棘头梅童鱼7个野生群体遗传结构分析[J]. 中国水产科学，2015，22（2）：233-242.