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摘要 [目的]利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术建立虾中38种农药残留的快速筛查方法。[方法]采用50%乙腈水溶液作溶剂、QuEChERS提取盐包和Oasis PRiME HLB固相萃取载体作吸附剂，实现了虾肉样品中38种目标物的同时提取和有效净化。目标药物经ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 μm，21 mm×50 mm）色谱柱分离，以10 mmol/L乙酸铵-甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，使用电喷雾离子源，在正离子模式下进行全扫描，可在10 min内实现38种农药的良好分离。[结果]虾中38种农药的定量限（LOQ）为0.5～1.5 μg/kg;3个加标水平的平均回收率为71.4%～97.9%，相对标准偏差（RSD）为4.1%～7.6%。[结论]该方法简便快速、灵敏度较高，可用于虾中38种农药的快速筛查。
关键词 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱;农药残留;虾;快速筛查
中图分类号 TS 254.7 文献标识码 A
文章編号 0517-6611（2021）16-0193-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.052 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Rapid Screening of 38 Pesticide Residues in Shrimp by Ultra Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry
KANG Jun-jie1，2，WANG Xue-song1，2，DONG Li-xue1，2 et al （1.Tangshan City Food and Drug Comprehensive Inspection and Testing Center，Tangshan，Hebei 063000;2.Hebei Agricultural Product Quality and Safety Testing Technology Innovation Center， Tangshan，Hebei 063000）
Abstract [Objective] An analytical method was established for the simultaneous determination of 38 pesticide residues in shrimp by ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry.[Method] Using 50% acetonitrile aqueous solution as the solvent， QuEChERS extraction salt packet and Oasis PRiME HLB solid-phase extraction carrier as the adsorbent， the simultaneous extraction and effective purification of 38 target substances in shrimp samples were achieved.The target drug was separated by ACQUITY UPLC HSS T3 （1.8 μm， 21 mm×50 mm） chromatographic column， and 10 mmol/L ammonium acetate-methanol and 0.1% formic acid aqueous solution were used as mobile phases for gradient elution.The electrospray ion source was used for a full scan in positive ion mode could achieve good separation of 38 pesticides within 10 minutes.[Result] The limit of quantification （LOQ） of 38 pesticides in shrimp was 0.5-1.5 μg/kg; the average recovery of the three spiked levels was 71.4%-97.9%， and the relative standard deviation （RSD） was 4.1%-7.6%.[Conclusion] The method is simple， rapid and highly sensitive， and can be used for rapid screening of 38 pesticides in shrimp.
Key words Ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry;Pesticides residues;Shrimp;Rapid screening
随着人们生活水平的提高，虾已经成为日常生活的营养品之一，其安全性问题受到越来越多的关注。虾的安全问题的主要表现是水体环境的污染，有机磷类农药由于杀虫效果好、价格低、范围广等特点，使其成为农业生产中主要的农药品种。农药在水生生物体中富集，对人类的健康造成很大的隐患，亟需对其进行监控[1-3]。人类长期进食含农药残留的虾肉，会对身体造成不良影响，如急性中毒、慢性中毒、干扰内分泌系统、毒害全身多脏器等危害，对身体健康的危害不容忽视[4-6]。农药一直以来是蔬菜水果中检测的重点参数，但近几年根据报道虾肉中农药有检出的现象。考虑到养殖者用药的不确定性和复杂性，建立一种同时快速测定多种农药残留的检测方法刻不容缓。 目前，水产品中农药的快速检测方法大都采用气相质谱法和气相色谱-质谱法[7-10]，而虾中农药残留的检测报道较少[11-12]。为了提高大批量样品的检测效率，该研究采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF-MS法）快速筛查虾中38种农药残留，样品经过简单的QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）前处理后，直接过Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化，以期为虾的快速筛查提供参考。
1 材料与方法
1.1 仪器 X500R超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（美国 SCIEX 公司）;高速冷冻离心机（湖南 cence湘仪产品）。
1.2 试材 乙腈、甲酸、甲醇均为色谱纯（ 美国 Merck 公司）;乙酸铵（色谱纯，美国Sigma公司）;Oasis HLB、Oasis PRIME HLB固相萃取柱、QuEChERS提取盐包（美国 Waters公司）;十八烷基硅烷（ODS C 18，美國 Agilent 公司）;试验用水为超纯水（Millipore公司）。
标准品： 甲胺磷、甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜、氧乐果、毒死蜱、敌敌畏、敌百虫、三唑磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、伏杀硫磷、亚胺硫磷、特丁硫磷砜、倍硫磷、辛硫磷、丙溴磷、治螟磷、蝇毒磷、灭线磷、杀扑磷、乐果、甲基异柳磷、二嗪磷、甲氰菊酯、三唑酮、异菌脲、异丙甲草胺、秀灭净、氯苯嘧啶醇、涕灭威、涕灭威砜、克百威、3-羟基克百威、甲萘威、异丙威、多菌灵、吡虫啉，纯度均≥98%，天津阿尔塔科技有限公司。
1.3 标准溶液配制
分别吸取1 mL上述标准品，置于10 mL棕色容量瓶中，用丙酮定容至刻度，制成10 μg/mL的标准储备液，-20 ℃保存。试验用丙酮稀释上述标准储备液，配制成不同浓度的混合标准使用液，于4 ℃保存。
1.4 样品预处理
取2.00 g均质的虾肉样品至50 mL离心管中，加入50%乙腈水20 mL混匀，用手振摇样品1 min。然后加入QuEChERS提取包，并大力振摇离心管1 min。在3 500 r/min高速离心5 min，取5 mL上清液直接过Oasis PRIME HLB固相萃取柱，收集流出液。在40 ℃下氮吹近干，用1 mL流动相复溶，过0.22 μm滤膜，上机待测定。
取2.00 g虾肉空白样品，每份样品按上述过程进行处理，得到的基质提取液用来稀释标准储备液。
1.5 色谱-质谱条件
1.5.1 液相色谱条件。色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3 （1.8 μm，21 mm×50 mm）;柱温45 ℃;进样体积10 μL;流速0.300 mL/min;流动相A为水相体积分数0.1%甲酸水，B为有机相10 mmol/L乙酸铵-甲醇。梯度洗脱程序为0～0.5 min，A为95%，0.5～2.0 min，A由95%线性降至70%，2.0～8.0 min，A由70%线性降至5%，再回到初始状态保持2 min。
1.5.2 质谱条件。采用电喷雾离子源（ESI），扫描方式为正离子模式（ESI+），扫描范围为 m/z 80～1 000，毛细管电压 5.5 kV;鞘气压力344.7 kPa，气帘气压力241.3 kPa，温度500 ℃，辅助气压力344.7 kPa，碰撞反应气压力48.3 kPa;去簇电压80 V，碰撞能量10 V;为了保障质量数精度，用SEIEX公司提供的ESI+溶液，对仪器质量轴进行质量校正，参比离子为 m/z 132.904 88、m/z 266.159 81、m/z 354.212 24、m/z 442.264 67、m/z 609.280 66、m/z 829.539 33、m/z 961.436 94、m/z 146.732 24、m/z 1 561.603 30、m/z 2 034.625 45和 m/z 2 149.496 51。
2 结果与分析
2.1 液相色谱条件优化 该试验选用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱进行分析，考察了0.1%甲酸水、1%甲酸水、10 mmol/L 乙酸铵-甲醇、10 mmol/L 乙酸铵-乙腈、乙腈和甲醇6种流动相对38种农药的分离、离子化效率和峰型的影响。结果表明，当流动相不加酸或酸度较高时，38种目标化合物的响应值都偏小，提取的效率低。当选用0.1%甲酸水时，目标化合物的峰分离较好，响应值增大，峰形好。而不加10 mmol/L乙酸铵的甲醇或乙腈的色谱峰明显提前，分离效果较差，部分化合物的提取效率低。与乙腈相比，甲醇作为流动相可以获得更好的分离度，所以试验水相采用0.1%甲酸水，有机相采用10 mmol/L乙酸铵-甲醇作为流动相进行梯度洗脱，实现目标化合物的有效分离。
2.2 质谱条件优化
根据国内近几年在虾、蟹等水产品中农药残留的检出情况，最终确定了38种常用农药。将这38种目标化合物配制成质量浓度为100 ng/mL的混合标准溶液。应用超高效液相色谱仪进行色谱分离，Q-TOF进行质谱信息采集，在ESI正离子模式下，在 m/z 80～1 000范围内进行一级质谱全扫描分析，在不同的碰撞电压下进行二级质谱扫描分析，收集化合物的保留时间、母离子精确分子质量、质量误差、二级全扫描图及质谱碎片数据等信息，以此建立完整的38种农药的质谱筛查谱库。谱库中应包含38种目标化合物的名称、保留时间等信息，具体分析参数见表1。通过比较各目标化合物的离子色谱峰的响应值和分离度，分别优化毛细管电压、鞘气压力、辅助气压力、去簇电压、碰撞能量等质谱参数，38种农药的提取离子色谱图见图1，以毒死蜱为例，其一级质谱图和二级质谱图见图2。 2.3 样品前处理方法的选择 该试验比较不同提取溶剂，提取目标化合物，同时沉淀蛋白。选择体积分数10%乙腈水、50%乙腈水、80%乙腈水作为3种提取液，进行加标水平为50 μg/kg 的回收率试验，平行测定3次。结果显示，不同提取溶剂对 38种农药残留的提取效果相差不多。50%乙腈水的提取回收率为78.2%～92.4%，相对标准偏差（RSD）为3.5%～5.3%，优于10%乙腈水（回收率为 53.8%～82.1%，RSD为4.2%～7.1%）和80%乙腈水（回收率为67.0%～83.2%，RSD为4.1%～8.2%）。因此该试验最终选择50%乙腈水作为提取溶剂。
虾肉样品中含有丰富的蛋白和脂肪等干扰物会造成试验过程基质干扰，因此对虾样品进行净化处理是必要的。该试验选取了Oasis PRIME HLB、Oasis HLB、C 18这3种固相萃取柱进行比较试验，结果表明，与Oasis HLB和C 18相比，Oasis PRIME HLB固相萃取柱能有效去除基质干扰，基质抑制改善明显，目标化合物均有较高的回收率。同时比较了Oasis PRIME HLB柱无活化和平衡过程，采用直接上样品净化方式，对38种农药目标化合物进行处理，结果表明，此固相萃取柱活化平衡步骤对此次试验的38种目标化合物回收率影响不大，故选用Oasis PRIME HLB小柱进行净化，达到样品中目标化合物快速筛查的目的。
2.4 方法学验证
2.4.1 标准曲线和定量限。
用空白的虾肉样品基质，配制标准溶液。以化合物的离子峰面积 Y 为纵坐标、相应质量浓度 X （μg/kg）为横坐标绘制标准曲线，38种农药的相关系数、线性范围和定量限见表2。取空白虾肉样品，按该试验方法进行样品的预处理，得到各目标化合物的信噪比为10 （S/N =10）的浓度，确定各目标化合物的定量限（LOQ）。从表2可看出，在 0.5～50.0 μg/kg 38种目标化合物的线性关系良好（ R2 >0.99），且其定量限为0.5～1.5 μg/kg。
2.4.2 回收率和精密度。
在空白蝦肉样品中添加3个不同浓度（5、10、20 μg/kg）的38种混合标准溶液，按“1.4”方法进行提取，用UPLC-Q-TOF进行测定目标化合物。每一个添加浓度重复测定6次进行试验，计算平均回收率和RSD。结
果发现，虾肉中38种农药的加标回收率为71.4%～ 97.9%，
RSD为4.1%～7.6%。
2.5 样品分析 按该试验方法对唐山地区超市、农贸市场采集到的30批虾样品进行筛查检测分析，结果发现均未检出该研究的38种农药。
3 小结
该研究建立了超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF）测定虾肉样品中38种农药残留的快速筛查方法，其前处理过程简单、快速、通量大、准确性高。UPLC-Q-TOF法在虾肉样品中农药残留快速筛查检测方面有明显优势，可一次分析出数百种不同目标化合物，在农药残留筛查领域值得深入研究。
参考文献
[1] 李建科.食品毒理学[M].北京：中国计量出版社，2007： 277-283.
[2] RAGNARSDOTTIR K V.Environmental fate and toxicology of organophosphate pesticides[J].J Geol Soc，2000，157（4）：859-876.
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[5] 王耀，刘少彬，谢翠美，等.加速溶剂萃取凝胶渗透色谱/固相萃取净化气相色谱质谱法测定咸鱼中有机磷农药残留[J].分析化学，2011，39（1）：67-71.
[6] 赵李娜.珠三角河网水环境中7种拟除虫菊酯类农药残留及风险评价研究[D].上海：上海海洋大学，2014.
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关键词 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱;农药残留;虾;快速筛查
中图分类号 TS 254.7 文献标识码 A
文章編号 0517-6611（2021）16-0193-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.052 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Rapid Screening of 38 Pesticide Residues in Shrimp by Ultra Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry
KANG Jun-jie1，2，WANG Xue-song1，2，DONG Li-xue1，2 et al （1.Tangshan City Food and Drug Comprehensive Inspection and Testing Center，Tangshan，Hebei 063000;2.Hebei Agricultural Product Quality and Safety Testing Technology Innovation Center， Tangshan，Hebei 063000）
Abstract [Objective] An analytical method was established for the simultaneous determination of 38 pesticide residues in shrimp by ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry.[Method] Using 50% acetonitrile aqueous solution as the solvent， QuEChERS extraction salt packet and Oasis PRiME HLB solid-phase extraction carrier as the adsorbent， the simultaneous extraction and effective purification of 38 target substances in shrimp samples were achieved.The target drug was separated by ACQUITY UPLC HSS T3 （1.8 μm， 21 mm×50 mm） chromatographic column， and 10 mmol/L ammonium acetate-methanol and 0.1% formic acid aqueous solution were used as mobile phases for gradient elution.The electrospray ion source was used for a full scan in positive ion mode could achieve good separation of 38 pesticides within 10 minutes.[Result] The limit of quantification （LOQ） of 38 pesticides in shrimp was 0.5-1.5 μg/kg; the average recovery of the three spiked levels was 71.4%-97.9%， and the relative standard deviation （RSD） was 4.1%-7.6%.[Conclusion] The method is simple， rapid and highly sensitive， and can be used for rapid screening of 38 pesticides in shrimp.
Key words Ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry;Pesticides residues;Shrimp;Rapid screening
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1 材料与方法
1.1 仪器 X500R超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（美国 SCIEX 公司）;高速冷冻离心机（湖南 cence湘仪产品）。
1.2 试材 乙腈、甲酸、甲醇均为色谱纯（ 美国 Merck 公司）;乙酸铵（色谱纯，美国Sigma公司）;Oasis HLB、Oasis PRIME HLB固相萃取柱、QuEChERS提取盐包（美国 Waters公司）;十八烷基硅烷（ODS C 18，美國 Agilent 公司）;试验用水为超纯水（Millipore公司）。
标准品： 甲胺磷、甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜、氧乐果、毒死蜱、敌敌畏、敌百虫、三唑磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、伏杀硫磷、亚胺硫磷、特丁硫磷砜、倍硫磷、辛硫磷、丙溴磷、治螟磷、蝇毒磷、灭线磷、杀扑磷、乐果、甲基异柳磷、二嗪磷、甲氰菊酯、三唑酮、异菌脲、异丙甲草胺、秀灭净、氯苯嘧啶醇、涕灭威、涕灭威砜、克百威、3-羟基克百威、甲萘威、异丙威、多菌灵、吡虫啉，纯度均≥98%，天津阿尔塔科技有限公司。
1.3 标准溶液配制
分别吸取1 mL上述标准品，置于10 mL棕色容量瓶中，用丙酮定容至刻度，制成10 μg/mL的标准储备液，-20 ℃保存。试验用丙酮稀释上述标准储备液，配制成不同浓度的混合标准使用液，于4 ℃保存。
1.4 样品预处理
取2.00 g均质的虾肉样品至50 mL离心管中，加入50%乙腈水20 mL混匀，用手振摇样品1 min。然后加入QuEChERS提取包，并大力振摇离心管1 min。在3 500 r/min高速离心5 min，取5 mL上清液直接过Oasis PRIME HLB固相萃取柱，收集流出液。在40 ℃下氮吹近干，用1 mL流动相复溶，过0.22 μm滤膜，上机待测定。
取2.00 g虾肉空白样品，每份样品按上述过程进行处理，得到的基质提取液用来稀释标准储备液。
1.5 色谱-质谱条件
1.5.1 液相色谱条件。色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3 （1.8 μm，21 mm×50 mm）;柱温45 ℃;进样体积10 μL;流速0.300 mL/min;流动相A为水相体积分数0.1%甲酸水，B为有机相10 mmol/L乙酸铵-甲醇。梯度洗脱程序为0～0.5 min，A为95%，0.5～2.0 min，A由95%线性降至70%，2.0～8.0 min，A由70%线性降至5%，再回到初始状态保持2 min。
1.5.2 质谱条件。采用电喷雾离子源（ESI），扫描方式为正离子模式（ESI+），扫描范围为 m/z 80～1 000，毛细管电压 5.5 kV;鞘气压力344.7 kPa，气帘气压力241.3 kPa，温度500 ℃，辅助气压力344.7 kPa，碰撞反应气压力48.3 kPa;去簇电压80 V，碰撞能量10 V;为了保障质量数精度，用SEIEX公司提供的ESI+溶液，对仪器质量轴进行质量校正，参比离子为 m/z 132.904 88、m/z 266.159 81、m/z 354.212 24、m/z 442.264 67、m/z 609.280 66、m/z 829.539 33、m/z 961.436 94、m/z 146.732 24、m/z 1 561.603 30、m/z 2 034.625 45和 m/z 2 149.496 51。
2 结果与分析
2.1 液相色谱条件优化 该试验选用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱进行分析，考察了0.1%甲酸水、1%甲酸水、10 mmol/L 乙酸铵-甲醇、10 mmol/L 乙酸铵-乙腈、乙腈和甲醇6种流动相对38种农药的分离、离子化效率和峰型的影响。结果表明，当流动相不加酸或酸度较高时，38种目标化合物的响应值都偏小，提取的效率低。当选用0.1%甲酸水时，目标化合物的峰分离较好，响应值增大，峰形好。而不加10 mmol/L乙酸铵的甲醇或乙腈的色谱峰明显提前，分离效果较差，部分化合物的提取效率低。与乙腈相比，甲醇作为流动相可以获得更好的分离度，所以试验水相采用0.1%甲酸水，有机相采用10 mmol/L乙酸铵-甲醇作为流动相进行梯度洗脱，实现目标化合物的有效分离。
2.2 质谱条件优化
根据国内近几年在虾、蟹等水产品中农药残留的检出情况，最终确定了38种常用农药。将这38种目标化合物配制成质量浓度为100 ng/mL的混合标准溶液。应用超高效液相色谱仪进行色谱分离，Q-TOF进行质谱信息采集，在ESI正离子模式下，在 m/z 80～1 000范围内进行一级质谱全扫描分析，在不同的碰撞电压下进行二级质谱扫描分析，收集化合物的保留时间、母离子精确分子质量、质量误差、二级全扫描图及质谱碎片数据等信息，以此建立完整的38种农药的质谱筛查谱库。谱库中应包含38种目标化合物的名称、保留时间等信息，具体分析参数见表1。通过比较各目标化合物的离子色谱峰的响应值和分离度，分别优化毛细管电压、鞘气压力、辅助气压力、去簇电压、碰撞能量等质谱参数，38种农药的提取离子色谱图见图1，以毒死蜱为例，其一级质谱图和二级质谱图见图2。 2.3 样品前处理方法的选择 该试验比较不同提取溶剂，提取目标化合物，同时沉淀蛋白。选择体积分数10%乙腈水、50%乙腈水、80%乙腈水作为3种提取液，进行加标水平为50 μg/kg 的回收率试验，平行测定3次。结果显示，不同提取溶剂对 38种农药残留的提取效果相差不多。50%乙腈水的提取回收率为78.2%～92.4%，相对标准偏差（RSD）为3.5%～5.3%，优于10%乙腈水（回收率为 53.8%～82.1%，RSD为4.2%～7.1%）和80%乙腈水（回收率为67.0%～83.2%，RSD为4.1%～8.2%）。因此该试验最终选择50%乙腈水作为提取溶剂。
虾肉样品中含有丰富的蛋白和脂肪等干扰物会造成试验过程基质干扰，因此对虾样品进行净化处理是必要的。该试验选取了Oasis PRIME HLB、Oasis HLB、C 18这3种固相萃取柱进行比较试验，结果表明，与Oasis HLB和C 18相比，Oasis PRIME HLB固相萃取柱能有效去除基质干扰，基质抑制改善明显，目标化合物均有较高的回收率。同时比较了Oasis PRIME HLB柱无活化和平衡过程，采用直接上样品净化方式，对38种农药目标化合物进行处理，结果表明，此固相萃取柱活化平衡步骤对此次试验的38种目标化合物回收率影响不大，故选用Oasis PRIME HLB小柱进行净化，达到样品中目标化合物快速筛查的目的。
2.4 方法学验证
2.4.1 标准曲线和定量限。
用空白的虾肉样品基质，配制标准溶液。以化合物的离子峰面积 Y 为纵坐标、相应质量浓度 X （μg/kg）为横坐标绘制标准曲线，38种农药的相关系数、线性范围和定量限见表2。取空白虾肉样品，按该试验方法进行样品的预处理，得到各目标化合物的信噪比为10 （S/N =10）的浓度，确定各目标化合物的定量限（LOQ）。从表2可看出，在 0.5～50.0 μg/kg 38种目标化合物的线性关系良好（ R2 >0.99），且其定量限为0.5～1.5 μg/kg。
2.4.2 回收率和精密度。
在空白蝦肉样品中添加3个不同浓度（5、10、20 μg/kg）的38种混合标准溶液，按“1.4”方法进行提取，用UPLC-Q-TOF进行测定目标化合物。每一个添加浓度重复测定6次进行试验，计算平均回收率和RSD。结
果发现，虾肉中38种农药的加标回收率为71.4%～ 97.9%，
RSD为4.1%～7.6%。
2.5 样品分析 按该试验方法对唐山地区超市、农贸市场采集到的30批虾样品进行筛查检测分析，结果发现均未检出该研究的38种农药。
3 小结
该研究建立了超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF）测定虾肉样品中38种农药残留的快速筛查方法，其前处理过程简单、快速、通量大、准确性高。UPLC-Q-TOF法在虾肉样品中农药残留快速筛查检测方面有明显优势，可一次分析出数百种不同目标化合物，在农药残留筛查领域值得深入研究。
参考文献
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